Лекция 4 ЗАЩИТА РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ

Проблемы фитопатологии — это часть более фундаментальной экологической проблемы, возникшей вследствие гигантского роста населения Земли и издержек научно-технического прогресса. Поэтому для ее решения следует познать естественные связи в биосфере, выяснить, какие из этих связей нарушены, и хотя бы частично компенсировать нарушения более грамотным хозяйствованием. Настоящая глава посвящена именно компенсированию и хозяйствованию.

Цель защиты растений — защита от эпифитотий. Если для врача жизнь каждого человека бесценна, то дли фитопатолога гибель тысячи колосьев пшеницы в ноле, где растут миллионы, составит лишь доли процента. Более того, присутствие небольшого количества паразита даже необходимо, если мы хотим восстановить некоторые из нарушенных природных связей. Как было показано в предыдущей главе, химические сигналы зараженных растений могут достигать соседние, не зараженные, и иммунизировать их. Поскольку мы непрерывно сталкиваемся с высокой изменчивостью паразитических микроорганизмов, отдельные, даже очень действенные, мероприятия по защите растений дают временный эффект, поэтому необходима система, основанная на взаимодействии (интеграции) различных мероприятий. Южноафриканский фитопатолог Ван дер Планк писал о том, что "химическая промышленность и селекционеры куют отличные тактические средства борьбы, но стратегию определяет только эпифитотиология" ^[1].

Селекция и сорторазмещение болезнеустойчивых сортов

Выдающийся русский миколог и фитопатолог А. А. Ячевский называл селекцию самым действенным средством защиты растений от болезней. Историю селекции растений на иммунитет можно разделить на несколько периодов.

Внутрипопуляционные отборы

Первый период был связан с бессознательной селекцией сортов-популяций сельским населением (внутрипопуляционный отбор). Оставляя на семена только самые урожайные и здоровые экземпляры, крестьяне ежегодно вели отбор менее поражаемых растений. Поэтому сорта местной селекции были относительно устойчивыми к болезням и гетерогенными, а гетерогенность растений-хозяев, как было сказано, сдерживает размножение паразитов.

Селекция чистолинейных сортов

В 20-х гг. XX в. начался второй период селекции — создание чистолинейных сортов, у которых все гены находятся в одинаковом (гомозиготном) состоянии и не расщепляются у потомства (теорию чистых линий создал незадолго до этого знаменитый датский генетик В. Л. Иогансен, который ввел в науку слово ген). Основное преимущество чистолинейного сорта заключалось в том, что созданная в результате длительного селекционного процесса комбинация положительных признаков сохраняется неизменной в поколениях. Но для того чтобы чистолинейный сорт долго жил, он должен был, наряду с другими хорошими качествами, быть устойчивым к распространенным в зоне выращивания болезням. Для этого нужно было решить три задачи:

— найти устойчивых родственников сорта, над которым работал селекционер (поиск доноров устойчивости);

— ввести его гены устойчивости в геном хорошего, но восприимчивого сорта (разработка методов гибридизации);

— разработать методы отбора устойчивых растений в расщепляющейся гибридной популяции (разработка методов оценки устойчивости).

Теорию поиска допоров устойчивости разработал Н. И. Вавилов. В работе "Законы естественного иммунитета растений. Ключ к нахождению иммунных форм" он писал: "Иммунитет вырабатывается под влиянием естественного отбора только в тех условиях, которые содействуют инфекции, и, как правило, выявляется только там, где имеется в наличии тот или иной паразит, в отношении которого отбор вырабатывает иммунитет". По Вавилову, иммунные формы растений надо искать в генетических центрах происхождения иммунных растений. Например, родина пшеницы Кавказ, Иран, Малая Азия, Восточное Средиземноморье. В этих местах найдено наибольшее число видов пшеницы (только на Кавказе — 16 видов), многие из которых отличаются высокой устойчивостью к болезням или даже комплексной устойчивостью. Вавилов, будучи директором Всесоюзного института растениеводства (ВИР), сам посетил многие страны для сбора растительного материала и организовал комплексные экспедиции своих сотрудников. Результатом этих экспедиций стали огромные коллекции растений института, изучением которых занимались различные специалисты. Сотрудник института Вавилова П. М. Жуковский установил, что родина растения-хозяина может не совпадать с родиной его паразита, и в случае такого несовпадения устойчивые формы надо искать в местах происхождения паразита. Как уже было сказано, родина культурного картофеля — Южная Америка, родина его важнейшего паразита Phytophthora infestans — Центральная Америка. Устойчивые виды картофеля — доноры желательных генов — растут не в Южной, а в Центральной Америке. Другой пример: во второй половине XX в. по всей Европе прокатились эпифитотии голубой плесени {ложной мучнистой росы) табака. Поскольку родина рода Nicotiana, к которому принадлежит культурный табак, — Южная Америка, селекционеры и фитопатологи начали поиск доноров устойчивости для гибридизации там, но все американские табаки оказались восприимчивыми к болезни. Вскоре выяснилось, что один из видов австралийских диких Табаков Nicotiana debney устойчив к болезни. Оказалось, что род Nicotiana возник на древнем южном материке Гондване до начала его раскола, а после дрейфа континентов большая часть видов оказалась в Южной Америке, но некоторые виды попали в отколовшуюся Австралию, где на них стал паразитировать местный возбудитель ложной мучнистой росы Peronospora tabacina.

Разработка методов гибридизации — вторая важная задача для создания чистолинейного сорта. Большинство местных, устойчивых к болезням образцов растений, хотя и родственны культурному виду, но имеют видовые различия, могут отличаться числом и строением хромосом и, следовательно, не способны скрещиваться с культурными видами и давать полноценное потомство. Перед формированием семян материнские и отцовские гаплоидные хромосомы (униваленты) должны сливаться и образовывать диплоидные биваленты. Если родители отличаются числом хромосом, да к тому же отдельные хромосомы настолько различаются по структуре, что не образуют биваленты, то и семена не сформируются. Кроме того, устойчивые формы, даже способные к скрещиванию с сортами, несут признаки дикости, которые могут испортить культурный сорт: дикие картофели образуют мелкие клубни с высоким ОГЛАВЛЕНИЕм ядовитых алкалоидов, у диких пшениц семена в колосе прочно не закреплены и осыпаются при созревании, что необходимо для дикаря, по привело бы к большим потерям при уборке культурного сорта, и т.п. А при гибридизации вместе с геном устойчивости потянутся и сцепленные с ним "плохие" гены.

Для преодоления свойств дикости используют беккросс, т.е. многократные последовательные скрещивания дикаря с культурным сортом — прием, ведущий к постепенному замещению генома дикаря геномом культурного сорта. Гибрид первого поколения скрещивают с культурным сортом, потомков от первого беккросса снова скрещивают с культурным сортом и т.д. Гибриды первого поколения имеют в среднем 50% генов дикаря, второго — 25%. третьего — 12,5% и т.д. При этом необходимо у каждого потомства отбирать для последующих скрещиваний только устойчивые гибриды, чтобы сохранить ген устойчивости, ради которого проводится вся работа.

Для преодоления нескрещиваемости селекционеры используют алкалоид декоративного луковичного растения безвременника (Colchicum) колхицин, который вызывает удвоение хромосом без разделения клетки на две (без цитокинеза). При этом возможны два варианта.

1. Снижение фертильности не влияет на качество продукции. В качестве примера рассмотрим работы выдающегося русского генетика и селекционера М. Ф. Терновского по передаче гена устойчивости к ВТМ из дикого табака Nicotiana glutinosa, двойной набор хромосом которого (2п) составляет 24 хромосомы, в культурный табак Nicotiana tabacum, геном которого содержит в два раза больше хромосом (2п = 48). Геномы этих видов различаются не только числом хромосом, но и их неспособностью спариваться друг с другом (поэтому диплоидный геном глютинозы можно обозначить как ГГ, где каждая буква Г подразумевает гаплоидный набор из 12 хромосом, а геном табака — как 7Т, где каждая буква — гаплоидный набор из 24 хромосом). Задача облегчается тем, что табак выращивают ради листьев, и уменьшение числа семян вследствие частичной потери репродукционной способности не сказывается на качестве сортов. Скрещивание этих видов дало гибрид (амфигаплоид) с неспаривавшимися 36 хромосомами — ГТ (12 + 24). Его колхицинирование привело к удвоению каждой хромосомы и образованию амфидиплоида ГГТТ с 72 хромосомами (36-ю парами). Таким образом, был получен фертильный (способный давать семена) новый вид, названный Nicotiana digluta (диглютиноза-табак). Этот вид давал нормальные семена, был устойчив к вирусу, но имел листья плохого качества. Его скрестили с табаком (первый беккросс): ГТ (36) х Т (24). 24 табачные хромосомы N. digluta образовали биваленты с хромосомами табака, а 12 глютинозных хромосом оказались без пар. Пыльцой такого несбалансированного гибрида начали опылять собственные цветки для того, чтобы постепенно убирать неспаренные и ненужные хромосомы. В каждом поколении микро- скопировали пыльцевые зерна для контролирования хромосомного набора и заражали листья ВТМ для отбора устойчивых потомков. Потомки во втором поколении (F2) имели 48—54 хромосомы, в третьем (F3) — 48—52, в четвертом (F4) 48—52, в пятом (F5) было найдено растение, имевшее 48 хромосом, из которых 23 пары Т-хромосом и одна пара Г (содержащая ген устойчивости). На основе этой устойчивой к болезни комбинации было получено много сортов табака. Через несколько лет их выращивания при анализе хромосомного состава не было обнаружено глютинозной хромосомы, которая в ходе неконтролируемых полевых скрещиваний была элиминирована и замещена недостающей табачной хромосомой. При этом устойчивость к ВТМ сохранилась вследствие спонтанной транслокации (обмена участками негомологичных хромосом) гена устойчивости в табачную хромосому.

2. Снижение фертильности недопустимо. Например, пшеницу и другие зерновые культуры выращивают ради семян, поэтому даже небольшое снижение их продукции и их качества не может быть компенсировано какими-либо иными свойствами. Нужны более сложные методы скрещиваний. Американский цитогенетик Е. Р. Сирс разработал методику передачи гена устойчивости к бурой ржавчине от дикого родича пшеницы эгилопса Aegilops umbellulata (2п = 14) к мягкой пшенице Triticum aestivum (2п = 42). Получить сразу гибриды между диплоидным эгилопсом и гексаплоидной пшеницей невозможно, поэтому Сирс сначала скрестил эгилопс с тетраплоидной двузернянкой (полбой, которой питался пушкинский Балда): Aegilops umbellulata (UU, 2п = 14) х Triticum dicoccum (ААВВ, 2п = 28). Каждая буква в этих обозначениях указывает на наличие генома из семи хромосом. Поскольку хромосомы наборов А, В и U не конъюгируют друг с другом, возник амфигаплоид ABU с 21 гаплоидной хромосомой. Колхицинированием удвоили каждую хромосому, получив фертильный амфидиплоид (гексаплоид) AABBUU. Затем амфидиплоид AABBUU скрестили с мягкой пшеницей Triticum aestivum AABBDD. Оба родителя имели по 42 хромосомы, из которых хромосомы геномов А и В спарились друг с другом, а хромосомы геномов D и U остатись в гаплоидном состоянии, т.е. возник гибрид AABBDU, имеющий 14 парных и 14 одиночных хромосом. Этот гибрид начали беккроссировать мягкой пшеницей для того, чтобы вызвать потерю неспаривающихся U-хромосом. В третьем беккроссе была найдена комбинация, имеющая 43 хромосомы вместо 42, AABBDD плюс одна хромосома генома U.

Генотипы, имеющие лишнюю хромосому, называют трисомиками. Лишняя хромосома может серьезно влиять на весь геном, у человека трисомия по 21 хромосоме вызывает у се носителей болезнь Дауна. Кроме того, хромосома эгилопса несет нежелательные свойства дикости. Поэтому на следующем этапе Сирс облучил пыльцу трисомика рентгеновскими лучами, вызывающими поломки хромосом и увеличивающими вероятность взаимных обменов участками хромосом (транслокаций). Облученную пыльцу он нанес на рыльца цветков своих же растений. Из 6091 полученных гибридов 132 оказались устойчивыми к ржавчине, 12 из них несли взаимные транслокации, но имели признаки дикости, и только одно растение полностью соответствовало фенотипу пшеницы. Из него был получен сорт "Трансфер". Геи устойчивости к ржавчине у этого сорта в результате взаимных транслокаций был перенесен из хромосомы эгилопса в хромосому пшеницы. Методика, разработанная Сирсом, в дальнейшем была использована для перенесения генов устойчивости к разным болезням в пшеницу из ржи, пырея и других злаков.

Разработка методов оценки устойчивости — третья задача на пути создания чистолинейного сорта. Для этих целей можно применять прямые и косвенные методы оценки.

Прямые методы заключаются в оценке реакции испытуемых растений на искусственное или естественное заражение их паразитом, т.е. выращивание растений в условиях инфекционного фона. Сам по себе инфекционный фон не способен обеспечить гарантированное заражение растений, ведь сколь сильно бы вы не опрыскивали листья картофеля спорами возбудителя фитофтороза, если погода сухая и жаркая, никакого развития болезни не будет (должны присутствовать все стороны "треугольника болезни"). Поэтому инфекционный фон должен быть помещен в условия, способствующие заражению и заболеванию, и тогда его называют инфекционно-провокационным. Инфекционные фоны для оценки листовых и корневых паразитов имеют свои особенности.

Заражение листьев возбудителями болезней (фитофтороза, ржавчины, мучнистой росы и т.д.) чаще всего проводится с помощью искусственного заражения — опрыскивания спорами в определенной концентрации. Так как погодные условия при полевых испытаниях непредсказуемы, опрыскивания часто проводят в теплицах или в лабораториях. Это позволяет упростить и удешевить методы испытания (например, заражают отделенные от растения листья картофеля во влажных камерах или всходы пшеницы в горшочках или даже отрезки листьев, помещенные на раствор бензимидазола).

Для оценки устойчивости растений к почвообитающим корневым паразитам мицелий и споры паразита предварительно размножают в колбах на стерильном субстрате, например зерне злаков, и затем равномерно вносят в почву делянок, на которых будут выращивать испытуемые растения.

Для оценки равномерности внесения инокулюма в почву и степени его агрессивности на определенном числе рендомизованных (расположенных случайно) делянок высевают высоко восприимчивый сорт, который должен быть поражен на 100%. Если не будет такого контроля, то отдельные гибриды могут остаться неповрежденными не вследствие их устойчивости, а вследствие непопадания инфекции на их корни, и тогда отбор на непоражаемость может продолжаться бесконечно долго, но без какого-либо эффекта.

Еще одно важное правило — использование для создания инфекционного фона максимально генетически разнообразного инокулюма. Пионеры использования инфекционных фонов в селекции, американские фитопатологи В. А. Ортон и И. Л. Болли собирали образцы пораженных фузаориозом растений в разных штатах США и их смесь вносили в почву испытуемых делянок. Сейчас можно размножать разные расы фузариевых грибов и смешивать их перед внесением в почву. Наземные части растений также часто желательно опрыскивать смесью рас.

После предварительно отбора устойчивых линий, проведенного тем или иным способом, окончательную оценку степени их устойчивости следует проводить в специальных питомниках. Эти питомники располагают в наиболее благоприятных для развития болезни зонах. В связи с ежегодными массовыми эпифиготиями в этих зонах искусственное заражение растений не проводят (достаточно естественного). Подобный питомник уже десятки лет функционирует в мексиканской долине Толука, на родине картофельной фитофторы. Мягкая зима позволяет перезимовывать ооспорам в почве, что способствует высокому генетическому разнообразию паразита и ранним инфекциям, а частые летние ливневые дожди обеспечивают быстрое развитие эпифитотий. В нашей стране подобный питомник работает на острове Сахалин, муссонный климат которого способствует ежегодному дождливому влажному лету. Во многих странах работают питомники для испытания устойчивости злаков к ржавчинам. Для повышения генетического разнообразия возбудителя стеблевой ржавчины предложено каждую делянку завершать посадкой куста барбариса., на котором протекает половой процесс гриба и вокруг которого, в связи с этим, образуется наиболее гетерогенная популяция паразита.

Косвенные методы оценки устойчивости основаны на анализе признаков растений, сопряженных с устойчивостью. Их можно разделить на морфологические, физиолого-биохимические и генетические. Морфологические признаки могут быть очень полезными для предварительного отбора. Например, сорта и гибриды пшеницы с повислыми листьями будут слабее поражаться ржавчиной и мучнистой росой пшеницы, чем сорта с листьями, расположенными перпендикулярно или под острым углом к стеблю. Но чтобы не ошибиться в подходах к оценке, надо знать биологию паразита. Ростки одноядерных (монокариотических) спор возбудителя стеблевой ржавчины пшеницы Puccinia graminis заражают листья барбариса, пробивая переклинальные стенки эпидермиса, поэтому сорта и виды, имеющие более толстые кутикулу и верхнюю стенку эпидермиса, слабее поражаются ржавчиной, чем сорта с менее плотными покровами. Но отбор сортов пшеницы на устойчивость к той же ржавчине по этому признаку бесполезен, потому что ростки двуядерных (дикариотических) спор заражают пшеницу через устьица, следовательно, более полезно провести сравнение числа устьиц на единицу поверхности листа, режима их работы и т.п.

Разработке физиолого-биохимических методов оценки устойчивости посвящено много исследований, но ничтожная их часть дошла до практической селекции, так как на пути их использования встречается немало преград. Например, было показано, что горизонтальная устойчивость картофеля к фитофторозу коррелирует с активностью фермента пероксидазы в листьях. Поскольку имеются простые и быстрые методы определения относительной активности пероксидазы, этот метод были рекомендован для селекционных отборов. Однако у позднеспелых сортов активность пероксидазы выше, чем у ранних, поэтому отбор на активность пероксидазы — это отбор на позднеспелость. Но позднеспелые сорта картофеля обычно имеют повышенную устойчивость к фитофторозу, так что по пероксидазе будет производиться отбор не на устойчивость, а на позднеспелость, и если среди гибридов будут находиться самые ценные раннеспелые устойчивые сеянцы, они будут отбракованы отбором на активность пероксидазы.

В последние годы все больше внимания привлекают генетические методы определения устойчивых форм в расщепляющемся потомстве. После того как была определена нуклеотидная последовательность некоторых генов устойчивости и синтезированы специфические для них праймеры, определение наличия этих генов у потомков от скрещиваний стало стандартным лабораторным приемом (см. гл. 5).