Газовый состав ростовых сред

Наличие кислорода в среде культивирования является одним из факторов, обеспечивающих рост культуры. При культивирова­нии клеток в малых объемах потребность клеток в кислороде мо­жет быть обеспечена за счет обдувания поверхности среды возду­хом или же смесью 95 % воздуха и 5 % углекислого газа.

Проблема обеспечения клеток кислородом возникает при крупномасштабных объектах культивирования. Это связано с тем, что кислород очень плохо растворим в культуральных средах, а по­требность клеток в нем и скорость его использования достаточно высокая. И в таких случаях кислород является лимитирующим фак­тором роста клеток в реакторе.

Решение проблемы обеспечения культур клеток кислородом осуществляется интенсивной аэрацией среды стерильным возду­хом и непрерывным контролем концентрации кислорода в среде.

Важным компонентом газовой смеси является двуокись угле­рода, которая может служить источником бикарбоната и поддер­живать величину рН. Для большинства клеток оптимальная кон­центрация С02 находится в пределах 0,5-2%.

В процессе культивирования клетки могут инфицироваться различными микроорганизмами (контаминантами). Экономические убытки от контаминации столь значительны, что часто возникает необходимость включения антибиотиков в культуральные среды, что обеспечивает биологическую чистоту культуры. При этом не­обходимо учитывать, что антибиотики угнетают и рост самой куль­туры. Поэтому антибиотики подбирают так, чтобы обеспечить ингибирование роста контаминантов с минимальным ингибированием роста культур клеток.

 

Наиболее часто применяют такие антибиотики как пенициллин (100 МЕ/мл), стрептомицин (50 мкг/мл) или гентамицин (50 мкг/ мл), которые являются мощными антибактериальными агентами. В качестве противогрибковых агентов используют амфотерицин В (25 мкг/мл) или нистатин (25 мкг/мл).

«Неопределенные» биологически активные добавки к сре­дам для культивирования клеток

Питательные среды не способны обеспечить интенсивный рост клеток в культуре. В таких средах (среда Игла, среда 199, среда Хепа Б-10), клеточные культуры способны сохраняться в хорошем состоянии в течение нескольких недель и их свойства остаются неизменными. Такие среды называют поддерживающи­ми средами. Внесение в поддерживающие среды сыворотки крови новорожденных телят или лошадей в концентрациях от 0,5 до 30 % по объему обеспечивает рост культуры клетокмлекопитающих в системе in vitro. И в таком случае такие среды называют росто­выми. Необходимо отметить, что телячья эмбриональная сыворот­ка превосходит по ростовым свойствам другие виды сывороток. Установленным фактом является то, что в сыворотке высокое со­держание биотина и других факторов роста.

Сыворотку получают либо от эмбрионов, либо от новорожденных телят. Получение сыворотки, ее обработка и стерилизация достаточно сложные задачи, решение которых требует специальной аппаратуры. При получении сыворотки необходимо устранить гемолиз эритроци­тов, осуществить ее очистку от вирусов, микоплазм и бактерий. Для этого ее фильтруют через серию фильтров с диаметром пор до 0,1 мкм. Тестируют на отсутствие вирусов и способность обеспечивать рост клеток в культуре. Разные партии сыворотки крови могут существен­но различаться по своим ростовым свойствам. Полученную сыворотку хранят при минус 20°С, ежемесячно проверяют ее свойства, она мо­жет храниться 6 и более месяцев, повторных циклов замораживания-оттаивания не допускается.

Сыворотка содержит более 1000 различных молекул, и пока еще не установлена связь между биохимическими и биофизическими свойства­ми сыворотки и ее способностью ускорять рост клеток т уНго. Однако целый ряд функции сыворотки в росте клеток уже установлен (табл. 21).

Использование сыворотки в питательных средах создает и це­лый ряд серьезных проблем (табл. 22). И эти проблемы, по мнению многих специалистов, могут быть решены только путем перехода на так называемые бессывороточные среды или среды с определен­ным составом.

Бессывороточные среды

Использование бессывороточных сред или сред с заменой наи­более важных для роста клеток компонентов сыворотки позволяет: улучшить воспроизводимость экспериментальных результатов и обеспечить стабильную продуктивность культур; значительно сни­зить вероятность заражения культуры вирусами или микоплазмами. Использование таких сред позволяет обеспечить относительно простую систему очистки продуктов метаболизма клеток.

 

ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК

Культивирование клеток в виде монослоя

Штаммы и линии клеток могут быть получены от различных фирм - поставщиков, или из коллекции клеточных культур.

Маточные культуры хранятся и транспортируются в жид­ком азоте и в твердой углекислоте, при температуре сухого льда. Поскольку клетки при температуре сухого льда обладают низ­кой жизнеспособностью, то сразу после их получения необхо­димо начать их культивирование или перезаморозить их в жид­ком азоте. В таком виде их можно хранить сколько угодно долго. Транспортировать клетки можно и в виде монослоя. Сосуды при этом должны быть просто закупорены.

Наряду со стационарными линиями клеток (НеLа,) в культи­вировании используются и первичные культуры клеток.

Первичными клеточными культурами называют клетки, по­лученные от животного, и которые поддерживаются в культуре до начала субкультивирования.

В качестве примера рассмотрим способ получения фибробла­стов кожи.

Выбрать участок кожи и обработать его стерилизующими агентами (70 % этанол). Вырезать стерильный участок 1 мм2 и пе­ренести его в стерильную чашку Петри. Добавить в чашку Петри несколько капель полной ростовой среды (например, минималь­ная среда Дульбекко) с 10 % эмбриональной сывороткой теленка и разрезать стерильным скальпелем кусочек на 5-10 маленьких кусочков.

Инкубировать кусочки при 37 °С в течение ночи. После это­го осторожно, чтобы не сместить фрагменты, добавить в чашку 3 мл полной среды и продолжать инкубацию. Рост фибробластов из фрагментов кожи может происходить в течение недели.

Легко получают первичную культуру макрофагов мыши. Для этого стерилизуют кожу брюшной стенки 70 % этиловым спир­том. После этого удаляют кожу с брюшной стенки. Инъецируют в брюшную полость 2,5 мл ростовой среды с 10 % сывороткой телен­ка и 10-ю единицами гепарина. Затем массируют брюшную стенку для отделения макрофагов в суспензию.

Отсасывают брюшную жидкость стерильной иглой и пере­носят суспензию в стерильную чашку Петри, считают количество клеток и распределяют их по чашкам так, чтобы в чашке было 10б клеток. В течение 30 мин макрофаги прикрепляются к чашке, а со­путствующие лимфоциты и фибробласты могут быть легко удале­ны сменой среды.

В настоящее время, кроме первичной культуры макрофагов получены и стационарные линии макрофагов.

Клетки способны прикрепляться к поверхности культурального сосуда и формировать монослой клеток. Такой тип культиви­рования называют монослоем. При достижении монослем границ культурального сосуда рост клеток может прекращаться. Это явле­ние получило название контактного торможения, так как при пол­ном заполнении поверхности дальнейший рост клеток тормозится.

Культивирование клеток в виде монослоя имеет ряд преиму­ществ перед суспензионным культивированием, т.е. культивирова­нием клеток в виде суспензии, которое обеспечивается непрерыв­ным перемешиванием суспензии клеток.

Культивирование клеток в монослое позволяет: легко менять культуральную среду, так как клетки прикреплены к поверхности; получать высокий уровень экспрессии клеточных продуктов, так как у клеток прикрепленных к субстрату эффективнее экспрессируются клеточные продукты; обеспечить максимальную гибкость исследо­ваний, поскольку может использоваться для любого типа клеток.

Наряду с этим, монослойная культура имеет и недостатки по сравнению с суспензионными культурами: возникают трудности при увеличении масштаба культивирования; требуют больших пространств; трудно определять динамику роста клеток; трудно обеспечивать гомогенность клеток.

Механизм прикрепления клеток к поверхности (стекло или пластик) может обеспечиваться электростатическими взаимодей­ствиями. Важным фактором в этом случае является суммарныйотрицательный заряд. Для увеличения эффекта взаимодействия, в частности органических поверхностей, проводят химическую обработку (окисляющими агентами, кислотами) или физические воздействия (электрический разряд, облучение ультрафиолетом, бомбардировка электронами высоких энергий).

Поверхность культурального сосуда может быть покрыта ве­ществом, которое облегчает прикрепление клеток. Чаще всего для этого используется коллаген и полиаминокислоты.

Клетки могут расти на мелких сферических носителях. В таком случае они могут рассматриваться как клеточные суспензии и для их выращивания могут применяться процессы и аппараты, разра­ботанные для суспензионных культур. Такое культивирование ис­пользуется в промышленности для получения вакцин и интерферо­на в ферментерах объемом до 1000 л. При этом культивировании используются первичные культуры клеток.

К сожалению, успешное выращивание клеток человека получается только в ферментерах лабораторного типа (объем реакторов до 20 л).

Хотя большое количество клеток животных вообще не выжи­вают в суспензионных культурах, для сохранения жизнеспособ­ности им необходимо образование межклеточных контактов (на­пример, культуры клеток человека WJ-88, МRС-5), суспензионные культуры более технологичны и их используют для наращивания клеточной массы.

 

 

СУСПЕНЗИОННЫЕ КУЛЬТУРЫ

Клетки крови лучше растут в суспензионной культуре по срав­нению с монослойными культурами. Для перевода клеток в суспен­зионную культуру используют различные способы адаптации к их росту в суспензии.

Одним из способов получения суспензионной культуры явля­ется селекция или система отбора. Способ основан на том, что в среде клеток, растущих в монослое, существуют клетки способные к росту в суспензии, их отбирают и в процессе длительной селек­ции получают клетки, способные расти в суспензии. Так были по­лучены суспензионные культуры LS из L-929 и НеLа-53 из НеLа.

Другим подходом к получению суспензионных культур явля­ется адаптация клеток к росту в суспензии. Для этого культуры интенсивно пересаживают и культивируют в суспензии, отбирают клетки, которые адаптированы к росту в суспензии. Однако всегда существует вероятность возврата клеток к росту в монослое.