Методы микроскопии
Метод микроскопии позволяет изучать морфологию микроорганизмов, подвижность, отношение микробов к красителям и пр. Обычно микроскопии подвергают специально приготовленные препараты бактерий в живом или окрашенном виде (фиксированные или убитые микробы). Наибольшее распространение в микробиологии получила микроскопия окрашенных препаратов - мазков, хотя исследование микроба в живом виде имеет свои неоспоримые преимущества.
Микроскопия живых неокрашенных клеток
Для этого применяют два способа: висячей капли и раздавленной капли. Микроскопия живых клеток позволяет изучать бактерии в неизменном виде и обнаруживать подвижность. У крупных бактерий возможно просматривание более тонкой структуры. При микроскопии живых микроорганизмов, следует предпринимать некоторые меры предосторожности.
Висячая капля.Для этого метода применяют специальные предметные стекла, которые имеют углубления в середине. Каплю исследуемого материала помещают на покровное стекло. Затем покровное стекло быстро переворачивают каплей вниз и накладывают на предметное стекло так, чтобы капля свободно свисала над углублением предметного стекла. Возможен еще один вариант: каплю наносят на покровное стекло и сверху накрывают предметным стеклом углублением над каплей. Перед этой процедурой предметное стекло недалеко от углубления смазывают вазелиновым маслом. После этого препарат совмещенных стекол быстро переворачивают, чтобы покровное стекло было наверху. Препарат микроскопируют в темном поле.
Раздавленная капля.На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала и накрывают покровным стеклом. Капля не должна выходить за края покровного стекла.
Возможно окрашивание таких препаратов 0,001 % раствором метиленовой синей или нейтрального красного. Препарат микроскопируют, затем опускают в банку с дез.раствором. Для микроскопирования применяют предметные стекла толщиной 1-1,5 мм, а покровные толщиной - 0,15-0,2 мм.
Приготовление мазка для окрашивания
Изучение микробов в окрашенном состоянии имеет несколько положительных сторон: широкая доступность практике, простота техники обработки, безопасность микроскопии, возможность более подробного изучения их структуры и морфологии.
Приготовление окрашенного препарата имеет несколько последовательных стадий: приготовление мазка, высушивание и фиксирование его, окраска мазка.
Подготовка предметных стекол и мазков. Первым этапом в процессе приготовления мазка является подготовка предметных стекол. Новые стекла кипятят в 1 % растворе соды, промывают водой.
Стекла бывшие в употреблении помещают на 2 ч в концентрированную серную кислоту, после чего кипятят в щелочи (сода, едкий натр), затем промывают водой. Готовые стекла хранят в склянке с притертой пробкой в 90 % спирте. Если они не хранились в спирте, их обезжиривают, например, натирая кусочком сухого мыла, а затем протирают чистой марлей. Капля воды на обезжиренном стекле растекается по поверхности.
Мазок - это небольшая часть исследуемого материала, тонким слоем нанесенная на предметное стекло, с целью последующего изучения морфологии и структуры микроорганизмов. В качестве материала может быть использована кровь, колонии микробов, нативный материал от больных и пр.
Если мазок готовят из бактериальной культуры, выросшей на плотной питательной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю 0,85 % раствора хлорида натрия.
Материал на бактериальной петле вносят в каплю жидкости и круговыми движениями растирают и распределяют его по предметному стеклу в виде круглого или овального мазка, диаметром 1-2 см2.
Материал из гноя или мокроты забирают с помощью петли или препаровальной иглы. Выбирают гнойные кусочки и наносят в центр предметного стекла.
Сверху на предметное стекло помещают второе предметное стекло, оставляя свободным левый край.
Взяв за свободные концы предметных стекол, раздвигают их в стороны. В результате чего получаются два мазка на обоих стеклах.
Кровь наносят на предметное стекло в виде капли недалеко от левого края.
Быстро берут второе предметное стекло в правую руку и прикладывают его к нижнему стеклу под углом в 450, затем под этим же углом придвигают к капле крови, которая растекается по его нижнему краю. Плотно прижимая верхнее стекло под таким же углом к нижнему, быстро продвигают его к правому краю нижнего стекла.
На нижнем стекле получается равномерный мазок крови, готовый для светового микроскопирования.
Мазок-отпечаток. Это прикладывание среза органа животных или от человека, во время оперативного вмешательства, к предметному стеклу.
Забор бактериальной массы для приготовления мазка. Микробы извлекают из посевов с помощью бактериальной петли. Это платиновая проволока - один конец которой загнут в виде маленького колечка, а другой вставлен в петледержатель, который и является ручкой. Петлю стерилизуют в пламени спиртовки, после чего ее следует остудить, прикоснувшись к незасеянной части питательной среды перед взятием петлей культуры.
Пробирку с посевом помещают в левую руку сверху на ребро ладони между большим, указательным и средним пальцами в несколько наклонном положении. Должна быть видна вся поверхность питательной среды с культурой. Петлю берут в правую руку как писчее перо. Далее зажимают пробку пробирки правой рукой между мизинцем и поверхностью ладони, прилежащей к мизинцу, и вытаскивают ее над пламенем спиртовки. Обжигают края пробирки над пламенем и вносят стерильную петлю в пробирку, захватывают колечком петли небольшое количество культуры и не прикасаясь к стенке пробирки вынимают петлю. Края пробирки слегка обжигают и закрывают пробкой. Петлю с культурой бактерий вносят в каплю жидкости на предметном стекле и распределяют в виде равномерного мазка. Петлю прожигают и ставят на место, а затем и пробирку с культурой.
Далее проводят подсушивание мазка в токе теплого воздуха горящей спиртовки или при комнатной температуре. Перегрева не допускать. Затем мазок фиксируют, трижды проводя предметное стекло с мазком над пламенем, делая круги диаметром 3 см. В результате этого микроорганизмы должны погибнуть, плотно прикрепившись к стеклу, становясь при этом восприимчивыми к окрашиванию.
Возможна фиксация мазка с помощью химических растворов, потому. что не все препараты можно фиксировать над пламенем (споры, пили, жгутики и пр.). Фиксатор наливают на мазок, либо в раствор погружают предметное стекло с мазком. Наибольшее распространение получили фиксаторы - этиловый спирт (10-15 мин) и смесь Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира), фиксация 10-15 мин. Приготовленные мазки подвергают окрашиванию.
Окрашивание мазка. Для окрашивания мазка применяют анилиновые красители. К настоящему времени описано достаточно много способов окраски мазков.
Существуют простые и сложные методы окраски. Это деление основано на количестве используемых красителей. При применении одной из красок - метод называют простым. При последовательном применении нескольких разных красок, метод называют сложным.
Простые способы можно использовать для индикации определенного штамма в смеси с другими микробами или среди структур крови, тканей и пр. Например, при поиске бруцелл мазок окрашивают карболовым фуксином. Бруцеллы окрашиваются в ярко-красный цвет, а остальные микроорганизмы в сине-голубой. Для простой окраски в основном применяют метиленовую синюю (синий цвет) и фуксин (красный цвет).
Растворы красок наносят на мазок (фуксин на 1-2 мин, а метиленовую синюю на -5 мин). Затем краску сливают, мазок промывают водой, просушивают, микроскопируют.
1. Применяют фуксин водный и карболовый.
а) карболовый фуксин:
фуксин основной - 1 г
карболовая кислота кристаллическая - 5 г
спирт 96 0 - 1 мл
глицерин - 4 капли
вода дистиллированная - 9 мл
б) водный фуксин:
карболовый фуксин - 10 г
дистиллированная вода - 9 мл
2. Метиленовая синяя. Готовится заранее в насыщенном растворе.
а) метиленовая синяя - 10 г
спирт 96о - 100 мл
б) щелочная синяя:
насыщенный раствор метиленовой синей - 30 г
едкий натр, 1 % - 1 мл
вода дистиллированная - 100 мл
Сложные методы окраски. Сложное окрашивание применяют для более детального выявления определенных структур микробов, а также для их дифференциации по способу окрашивания и пр. Наибольшее распространение и значение в микробиологии получили сложные методы окраски по Граму и Цилю-Нильсену. Особенно универсальным является метод Грама. Практически все бактерии могут при окраске по Граму проявить себя как грамположительные или грамотрицательные. Это может зависеть от многих причин:наличия клеточной стенки, присутствие в клеточной стенке пептидогликана и т.д.
Метод Грама.Практически все микроорганизмы при окраске по Граму приобретают синефиолетовое окрашивание (это грамположительные) или красное (грамотрицательные). Отрицательность или положительность бактерий при окраске определяется действием на клетку спирта: при отмывании первой краски спиртом, микробы будут грамотрицательными и их необходимо докрашивать второй краской; если первая окраска не отмывается, микробы называют грамположительными и они не нуждается во втором окрашивании. Действие спирта зависит от химической структуры клеточной стенки.
Методика окраски по Граму заключается в следующем:
1. На фиксированный мазок кладут небольшой кусок фильтровальной бумаги и наливают на него раствор генцианвиолета на 4-5 мин. После экспозиции бумагу снимают пинцетом, краситель сливают.
2. Наливают на мазок раствор Люголя на 1-2 мин, далее краску сливают.
3. На мазок наливают спирт 960 на 1 мин, его можно долить еще до прекращения отхождения фиолетового красителя.
4. Мазок промывают водой.
5. На мазок наносят раствор фуксина на 1-2 мин и сливают краску.
6. Мазок промывают водой, обсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.
Окраска по Граму имеет большое диагностическое значение. К грамположительным бактериям относятся: стафилококки, стрептококки, коринебактерии, микобактерии и др. К грамотрицательным бактериям относятся: менингококки, сальмонеллы, шигеллы, гонококки, протей и пр.
Основная ошибка при окраске - переобесцвечивание спиртом. В настоящее время известна модификация Синева, когда на мазок кладут фильтровальную бумажку, заранее пропитанную генцианвиолетом и высушенную. На такую бумажку наносят несколько капель воды, а остальное - по прописи.
Окраска по Цилю-Нильсену. Она предназначена для окраски кислотоустойчивых микроорганизмов, например, туберкулезных. Именно эту окраску применяют при выявление туберкулезных палочек в мокроте. Сущность метода заключается в одновременной окраске и разрыхлении клеточной стенки. Последующие манипуляции (обработка кислотой и второе докрашивание) дифференцируют кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии. Прокраске клеток способствует прогревание мазка. Некислотоустойчивые бактерии при обработке спиртом и кислотой обесцвечиваются и докрашиваются метиленовой синей в голубой цвет. Кислотоустойчивые микобактерии приобретают красный цвет.
Окраска по Цилю-Нильсену проводится следующим образом:
1. На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумажку и наносят раствор карболового фуксина и прогревают мазок до появления паров и еще в течение 5 мин.
2. Снимают бумажку, промывают мазок водой.
3. Наносят 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси спирта с кислотой хлороводородной, 1-2 мин для обесцвечивания.
4. Промывают мазок водой.
5. Докрашивают мазок раствором метиленовой синей, -5 мин.
6. Промывают мазок водой.
Метод получил признание и имеет диагностическое значение.
Окраска по Ожешко. Обычными методами споры не прокрашиваются. Сущность метода заключается в предварительном размягчении оболочки споры, а затем окрашивании. При таком способе споры хорошо прокрашиваются и не обесцвечиваются при дальнейшей обработке кислотой. В отличие от спор, вегетативные клетки обесцвечиваются и могут быть видимыми только при дополнительном прокрашивании.
Окраска проводится следующим способом:
1. Просушенный, но не фиксированный мазок, обрабатывают 2 мин 0,5 % раствором хлороводородной кислоты или соляной.
2. Прогревают препарат до появления паров, сливают кислоту.
3. Промывают водой.
4. Препарат просушивают, фиксируют над пламенем спиртовки.
5. Препарат обрабатывают карболовым фуксином Циля через фильтровальную бумажку, прогревают до появления паров и еще 4-5 мин. Фильтровальную бумажку следует снять пинцетом, а краску слить.
6. Мазок обрабатывают 5 % серной кислотой, 1-2 мин.
7. На мазок наливают метиленовую синюю, 5 мин.
8. Мазок промывают водой.
Окраска по Шефер и Фултон. Сущность метода сходна с предыдущим, с некоторыми вариациями. Первично проводится не только разрыхление оболочки споры, но и ее окраска. Второй краситель докрашивает вегетативные клетки.
Окраска проводится следующим способом:
1. На фиксированный мазок наносят 5 % раствор малахитового зеленого и 3-4 раза нагревают до появления паров.
2. Промывают мазок водой.
3. На мазок наносят 0,5 % раствор сафранина на 30 сек, с целью докрашивания.
4. Мазок промывают водой.
При таком способе окраски споры окрашиваются в зеленый цвет, а вегетативная клетка - в красный.
Окраска по Гинсу-Бури. Этот способ основан на двух методах - Бури (окраска фона с помощью черной туши) и Гинса (прокрашивание клетки фуксином). Метод применяют при выявлении у бактерий капсулы. При этом капсула остается неокрашенной, облегая красную клетку (фуксин) или синюю (метиленовая синяя), при этом фон окрашен тушью в темный цвет.
Окраска проводится следующим способом:
1. На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала. Рядом наносят каплю туши (автоклавированной). Обе капли перемешивают и размазывают по предметному стеклу как при исследовании крови.
2. Препарат просушивают, фиксируют над пламенем спиртовки.
3. Мазок окрашивают фуксином водным или сафранином.
4. Промывают мазок водой.
При этом фон темный, бактерии окрашиваются в красный цвет, их облегает кайма неокрашенной капсулы.
Окраска по Нейссеру. Способ основан на избирательном отношении микробов к щелочным (волютин) и кислым (цитоплазма) красителям.
Окраска проводится следующим образом:
1. На фиксированный мазок наносят ацетат синьки Нейссера, 2-3 мин.
2. Не промывая, обрабатывают мазок раствором Люголя, 10-30 сек.
3. Мазок промывают водой.
4. На мазок наносят водный раствор везувина или хрезоидина, 0,5 - 1 мин.
5. Мазок промывают водой.
При таком способе окраски зерна волютина клеток окрашиваются в темно-синий цвет, а цитоплазма докрашивается в желтый.
Окраска по Романовскому-Гимзе. Сущность метода заключается в избирательном окрашивании базофильных и оксифильных элементов клеток.
Окраска проводится следующим способом:
1. Мазок фиксируют химическим способом.
2. Раствор краски, приготовленный непосредственно перед употреблением, наносят на мазок, через 1 ч краску сливают.
3. Промывают мазок водой.
4. На мазок наносят 10 % раствор метиленовой синей, на 20-30 сек.
5. Препарат промывают водой.
При этом способе окраски цитоплазма окрашивается в голубой цвет, ядра клеток и зернистость в красно-фиолетовый. Это основной метод изучения морфологии паразитов крови и форменных элементов крови.
Окраска по Леффлеру. Этим способом окрашивают жгутики, вначале протравляя их, а затем докрашивая.
Окраска проводится следующим способом:
1. Для приготовления мазка используют 10-15 суточные культуры.
2. Взвесь бактерий готовят на дистиллированной воде, для чего бактериальной петлей берут материал не прикасаясь к конденсационной воде и переносят в пробирку с 2 мл дистиллированной воды.
3. Не взбалтывая воду в пробирке, держат петлю до полного распределения культуры в воде, образующей тонкую взвесь. Пробирку ставят в термостат при 37о С на 30 мин.
4. Предметное стекло проводят над пламенем спиртовки и дают остыть.
5. Пастеровской пипеткой наносят на стекло 5 капель взвеси и подсушивают на воздухе, а затем быстро проводят над пламенем.
6. На фиксированный мазок наносят смесь для протравы, подогревая до появления паров, 1 мин.
7. Мазок промывают водой.
8. На мазок наносят фуксин Циля, слабо подогревают, 3-4 мин.
9. Мазок промывают водой.
При таком способе окраски жгутики набухают, становятся видимыми и прокрашенными в красный цвет.
Окраска по Здродовскому. Метод применяют для окраски риккетсий.
Окраска проводится следующим способом.
1. На фиксированный в пламене мазок наносят водный раствор фуксина Циля, 5 мл.
2. Не промывая, наносят на мазок 0,5 % раствор лимонной кислоты, 1-3 сек.
3. Промывают мазок водой.
4. На мазок наносят 10 % раствор метиленовой синей, 20-30 сек.
5. Мазок промывают водой.
При таком способе риккетсии окрашиваются в розовый цвет (исключение составляют цуцугамуши, которые окрашивают по Романовскому-Гимзе).
Окраска по Морозову. Способ предназначен для окрашивания вирусов, жгутиков и пр. Еще его называют серебрением.
Окраску проводят следующим образом:
1. Нефиксированный мазок помещают в стакан с дистиллированной водой и фиксируют раствором № 1, одну мин.
2. Препарат вынимают из стакана, промывают водой, протравливают раствором № 2 и нагревают до появления паров, 1 мин.
3. Мазок промывают водой, после чего окрашивают раствором № 3, прогревая его до появления темно-коричневой окраски, 1-2 мин.
При таком способе окрашивания вирусы или жгутики приобретают темный цвет.
Окраска по Муромцеву. Это простой способ выявления телец Негри из суспензии аммониевого рога, полученной растиранием в ступе. Мазок фиксируют в смеси Никифорова.
1. Промывают мазок водой.
2. На мазок наносят синьку Мансона, 5-10 мин.
3. Промывают мазок 10 % раствором танина, 2-3 мин.
4. Наносят на мазок спирт 100о на 1,0 мин, сливают и просушивают.
При таком способе окраски тельца Негри окрашиваются бледно-фиолетовым цветом на бесцветном фоне.
Прописи некоторых красителей и растворов
1. Синька Леффлера:
насыщенный спиртовый раствор метиленовой синей - 30 мл
КОН 10 % - 1 мл
дистиллированная вода - 100 мл
2. Краситель Нейссера:
1. метиленовая синяя - 0,1 г
спирт 960 - 2 мл
крепкая уксусная кислота - 5 мл
дистиллированная вода - 100 мл
2. везувин - 2 г
спирт 960 - 60 мл
дистиллированная вода - 40 мл
Смесь кипятят, по охлаждении фильтруют.
3. Краситель Морозова:
Раствор № 1 (жидкость Рунге):
ледяная уксусная кислота - 1 мл
формалин 40 % - 2 мл
дистиллированная вода - 100 мл
Раствор № 2 (протрава):
танин - 5 г
карболовая кислота жидкая - 1 мл
дистиллированная вода - 100 мл
Раствор № 3 (краситель):
азотнокислое серебро - 5 г
дистиллированная вода - 100 мл
4. Краситель Романовского-Гимзе:
Содержит смесь красителей: метиленовая синяя, эозин, азур. К 10 мл воды дистиллированной, рН 6,8-7,0, перед окраской добавляют 10 капель краски и тотчас наливают на мазок.
5. Краситель по Граму.
1. карболовый генцианвиолет:
генцианвиолет - 1 г
кислота карболовая - 2 г
спирт 960 - 10 мл
дистиллированная вода - 100 мл
2. раствор Люголя:
калий йодистый - 2 г
йод кристаллический - 1 г
дистиллированная вода - 300 мл.
Морфология и структура микроорганизмов Сложные методы окраски. Сложное окрашивание применяют для более детального выявления определенных структур микробов, а также для их дифференциации по способу окрашивания и пр. Наибольшее распространение и значение в микробиологии получили сложные методы окраски по Граму и Цилю-Нильсену. Особенно универсальным является метод Грама. Практически все бактерии могут при окраске по Граму проявить себя как грамположительные или грамотрицательные. Это может зависеть от многих причин:наличия клеточной стенки, присутствие в клеточной стенке пептидогликана и т.д.
Метод Грама.Практически все микроорганизмы при окраске по Граму приобретают синефиолетовое окрашивание (это грамположительные) или красное (грамотрицательные). Отрицательность или положительность бактерий при окраске определяется действием на клетку спирта: при отмывании первой краски спиртом, микробы будут грамотрицательными и их необходимо докрашивать второй краской; если первая окраска не отмывается, микробы называют грамположительными и они не нуждается во втором окрашивании. Действие спирта зависит от химической структуры клеточной стенки.
Методика окраски по Граму заключается в следующем:
7. На фиксированный мазок кладут небольшой кусок фильтровальной бумаги и наливают на него раствор генцианвиолета на 4-5 мин. После экспозиции бумагу снимают пинцетом, краситель сливают.
8. Наливают на мазок раствор Люголя на 1-2 мин, далее краску сливают.
9. На мазок наливают спирт 960 на 1 мин, его можно долить еще до прекращения отхождения фиолетового красителя.
10. Мазок промывают водой.
11. На мазок наносят раствор фуксина на 1-2 мин и сливают краску.
12. Мазок промывают водой, обсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.
Окраска по Граму имеет большое диагностическое значение. К грамположительным бактериям относятся: стафилококки, стрептококки, коринебактерии, микобактерии и др. К грамотрицательным бактериям относятся: менингококки, сальмонеллы, шигеллы, гонококки, протей и пр.
Основная ошибка при окраске - переобесцвечивание спиртом. В настоящее время известна модификация Синева, когда на мазок кладут фильтровальную бумажку, заранее пропитанную генцианвиолетом и высушенную. На такую бумажку наносят несколько капель воды, а остальное - по прописи.
Окраска по Цилю-Нильсену. Она предназначена для окраски кислотоустойчивых микроорганизмов, например, туберкулезных. Именно эту окраску применяют при выявление туберкулезных палочек в мокроте. Сущность метода заключается в одновременной окраске и разрыхлении клеточной стенки. Последующие манипуляции (обработка кислотой и второе докрашивание) дифференцируют кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии. Прокраске клеток способствует прогревание мазка. Некислотоустойчивые бактерии при обработке спиртом и кислотой обесцвечиваются и докрашиваются метиленовой синей в голубой цвет. Кислотоустойчивые микобактерии приобретают красный цвет.
Окраска по Цилю-Нильсену проводится следующим образом:
7. На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумажку и наносят раствор карболового фуксина и прогревают мазок до появления паров и еще в течение 5 мин.
8. Снимают бумажку, промывают мазок водой.
9. Наносят 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси спирта с кислотой хлороводородной, 1-2 мин для обесцвечивания.
10. Промывают мазок водой.
11. Докрашивают мазок раствором метиленовой синей, -5 мин.
12. Промывают мазок водой.
Метод получил признание и имеет диагностическое значение.
Окраска по Ожешко. Обычными методами споры не прокрашиваются. Сущность метода заключается в предварительном размягчении оболочки споры, а затем окрашивании. При таком способе споры хорошо прокрашиваются и не обесцвечиваются при дальнейшей обработке кислотой. В отличие от спор, вегетативные клетки обесцвечиваются и могут быть видимыми только при дополнительном прокрашивании.
Окраска проводится следующим способом:
9. Просушенный, но не фиксированный мазок, обрабатывают 2 мин 0,5 % раствором хлороводородной кислоты или соляной.
10. Прогревают препарат до появления паров, сливают кислоту.
11. Промывают водой.
12. Препарат просушивают, фиксируют над пламенем спиртовки.
13. Препарат обрабатывают карболовым фуксином Циля через фильтровальную бумажку, прогревают до появления паров и еще 4-5 мин. Фильтровальную бумажку следует снять пинцетом, а краску слить.
14. Мазок обрабатывают 5 % серной кислотой, 1-2 мин.
15. На мазок наливают метиленовую синюю, 5 мин.
16. Мазок промывают водой.
Окраска по Шефер и Фултон. Сущность метода сходна с предыдущим, с некоторыми вариациями. Первично проводится не только разрыхление оболочки споры, но и ее окраска. Второй краситель докрашивает вегетативные клетки.
Окраска проводится следующим способом:
5. На фиксированный мазок наносят 5 % раствор малахитового зеленого и 3-4 раза нагревают до появления паров.
6. Промывают мазок водой.
7. На мазок наносят 0,5 % раствор сафранина на 30 сек, с целью докрашивания.
8. Мазок промывают водой.
При таком способе окраски споры окрашиваются в зеленый цвет, а вегетативная клетка - в красный.
Окраска по Гинсу-Бури. Этот способ основан на двух методах - Бури (окраска фона с помощью черной туши) и Гинса (прокрашивание клетки фуксином). Метод применяют при выявлении у бактерий капсулы. При этом капсула остается неокрашенной, облегая красную клетку (фуксин) или синюю (метиленовая синяя), при этом фон окрашен тушью в темный цвет.
Окраска проводится следующим способом:
5. На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала. Рядом наносят каплю туши (автоклавированной). Обе капли перемешивают и размазывают по предметному стеклу как при исследовании крови.
6. Препарат просушивают, фиксируют над пламенем спиртовки.
7. Мазок окрашивают фуксином водным или сафранином.
8. Промывают мазок водой.
При этом фон темный, бактерии окрашиваются в красный цвет, их облегает кайма неокрашенной капсулы.
Окраска по Нейссеру. Способ основан на избирательном отношении микробов к щелочным (волютин) и кислым (цитоплазма) красителям.
Окраска проводится следующим образом:
6. На фиксированный мазок наносят ацетат синьки Нейссера, 2-3 мин.
7. Не промывая, обрабатывают мазок раствором Люголя, 10-30 сек.
8. Мазок промывают водой.
9. На мазок наносят водный раствор везувина или хрезоидина, 0,5 - 1 мин.
10. Мазок промывают водой.
При таком способе окраски зерна волютина клеток окрашиваются в темно-синий цвет, а цитоплазма докрашивается в желтый.
Окраска по Романовскому-Гимзе. Сущность метода заключается в избирательном окрашивании базофильных и оксифильных элементов клеток.
Окраска проводится следующим способом:
6. Мазок фиксируют химическим способом.
7. Раствор краски, приготовленный непосредственно перед употреблением, наносят на мазок, через 1 ч краску сливают.
8. Промывают мазок водой.
9. На мазок наносят 10 % раствор метиленовой синей, на 20-30 сек.
10. Препарат промывают водой.
При этом способе окраски цитоплазма окрашивается в голубой цвет, ядра клеток и зернистость в красно-фиолетовый. Это основной метод изучения морфологии паразитов крови и форменных элементов крови.
Окраска по Леффлеру. Этим способом окрашивают жгутики, вначале протравляя их, а затем докрашивая.
Окраска проводится следующим способом:
10. Для приготовления мазка используют 10-15 суточные культуры.
11. Взвесь бактерий готовят на дистиллированной воде, для чего бактериальной петлей берут материал не прикасаясь к конденсационной воде и переносят в пробирку с 2 мл дистиллированной воды.
12. Не взбалтывая воду в пробирке, держат петлю до полного распределения культуры в воде, образующей тонкую взвесь. Пробирку ставят в термостат при 37о С на 30 мин.
13. Предметное стекло проводят над пламенем спиртовки и дают остыть.
14. Пастеровской пипеткой наносят на стекло 5 капель взвеси и подсушивают на воздухе, а затем быстро проводят над пламенем.
15. На фиксированный мазок наносят смесь для протравы, подогревая до появления паров, 1 мин.
16. Мазок промывают водой.
17. На мазок наносят фуксин Циля, слабо подогревают, 3-4 мин.
18. Мазок промывают водой.
При таком способе окраски жгутики набухают, становятся видимыми и прокрашенными в красный цвет.
Окраска по Здродовскому. Метод применяют для окраски риккетсий.
Окраска проводится следующим способом.
6. На фиксированный в пламене мазок наносят водный раствор фуксина Циля, 5 мл.
7. Не промывая, наносят на мазок 0,5 % раствор лимонной кислоты, 1-3 сек.
8. Промывают мазок водой.
9. На мазок наносят 10 % раствор метиленовой синей, 20-30 сек.
10. Мазок промывают водой.
При таком способе риккетсии окрашиваются в розовый цвет (исключение составляют цуцугамуши, которые окрашивают по Романовскому-Гимзе).
Окраска по Морозову. Способ предназначен для окрашивания вирусов, жгутиков и пр. Еще его называют серебрением.
Окраску проводят следующим образом:
4. Нефиксированный мазок помещают в стакан с дистиллированной водой и фиксируют раствором № 1, одну мин.
5. Препарат вынимают из стакана, промывают водой, протравливают раствором № 2 и нагревают до появления паров, 1 мин.
6. Мазок промывают водой, после чего окрашивают раствором № 3, прогревая его до появления темно-коричневой окраски, 1-2 мин.
При таком способе окрашивания вирусы или жгутики приобретают темный цвет.
Окраска по Муромцеву. Это простой способ выявления телец Негри из суспензии аммониевого рога, полученной растиранием в ступе. Мазок фиксируют в смеси Никифорова.
5. Промывают мазок водой.
6. На мазок наносят синьку Мансона, 5-10 мин.
7. Промывают мазок 10 % раствором танина, 2-3 мин.
8. Наносят на мазок спирт 100о на 1,0 мин, сливают и просушивают.
При таком способе окраски тельца Негри окрашиваются бледно-фиолетовым цветом на бесцветном фоне.
Прописи некоторых красителей и растворов
2. Синька Леффлера:
насыщенный спиртовый раствор метиленовой синей - 30 мл
КОН 10 % - 1 мл
дистиллированная вода - 100 мл
3. Краситель Нейссера:
1. метиленовая синяя - 0,1 г
спирт 960 - 2 мл
крепкая уксусная кислота - 5 мл
дистиллированная вода - 100 мл
2. везувин - 2 г
спирт 960 - 60 мл
дистиллированная вода - 40 мл
Смесь кипятят, по охлаждении фильтруют.
4. Краситель Морозова:
Раствор № 1 (жидкость Рунге):
ледяная уксусная кислота - 1 мл
формалин 40 % - 2 мл
дистиллированная вода - 100 мл
Раствор № 2 (протрава):
танин - 5 г
карболовая кислота жидкая - 1 мл
дистиллированная вода - 100 мл
Раствор № 3 (краситель):
азотнокислое серебро - 5 г
дистиллированная вода - 100 мл
4. Краситель Романовского-Гимзе:
Содержит смесь красителей: метиленовая синяя, эозин, азур. К 10 мл воды дистиллированной, рН 6,8-7,0, перед окраской добавляют 10 капель краски и тотчас наливают на мазок.
5. Краситель по Граму.
1. карболовый генцианвиолет:
генцианвиолет - 1 г
кислота карболовая - 2 г
спирт 960 - 10 мл
дистиллированная вода - 100 мл
2. раствор Люголя:
калий йодистый - 2 г
йод кристаллический - 1 г
дистиллированная вода - 300 мл.
Микроорганизмы достаточно многообразны по морфологии, однако, с определенными натяжками их можно поделить на несколько групп:кокковидные, бактериевидные, вибриоспировидные, мицелиевидные, вирусовидные, протистовидные. Эти группы могут делиться на подгруппы. Различия морфологии микробов между этими группами и внутри их имеет определенное диагностическое значение.
Кокковидные. Это бактерии шаровидной формы. Скорости их размножения и расхождения клеток различны, что отражается на расположении кокков в мазках. Различают несколько разновидностей расположения кокковидных. Если бактерии быстро расходятся после деления и в силу этого располагаются в мазке в виде монококков (по отдельности), то их называют микрококки. Если кокки делятся в одной плоскости и недостаточно быстро расходятся, то в мазках они выглядят как диплококки, т.е. парные кокки. При меньшей скорости разделения бактерий образуются цепочки кокков, имеющие родовое название - стрептококки.
Если бактерии делятся в трех плоскостях и медленно расходятся, то в мазках с плотной агаровой среды они образуют характерные скопления в виде гроздьев винограда и имеют родовое название - стафилококки. Тетракокки образуются в результате деления в двух плоскостях и благодаря относительно не высокой скорости расхождения кокков - в мазках образуются четверки кокков по две пары. Сарцины - это кокки, которые расположены в мазках в виде пакетов или тюков, по 8, 16, 32 и более клеток, при делении родительской клетки сразу в нескольких плоскостях.
Среди кокковидных - стрептококков, стафилококков, диплококков имеется достаточно много видов бактерий, патогенных и условно-патогенных для человека. Например, вид Saphylococcus aureus вызывает у человека около 100 заболеваний - от юношеских угрей до перитонита, сепсиса и др. Диплококки - Neisseria gonorrhea вызывают у человека гонорею, а Neisseria meningitidis -менингит и др. Стрептококки вызывают гнойные поражения тканей - рожа, ревматизм и др.
Бактериевидные. Эти бактерии представлены цилиндрическими или палочковидными формами бактерий.
В 1875 г немецкий ботаник Г. Кон обнаружил у сенной палочки споры и стал именовать бактериевидные формы, образующие споры - бациллами, а культуры не образующие споры - бактериями. Образующие споры палочки, которые имеют веретенообразную форму, назвали клостридиями. По расположению клеток бактерий различают:диплобактерии - располагающиеся в мазках попарно и стрептобактерии - располагающиеся в виде цепочек. Бактериевидные различаются по длине, ширине, форме концов, расположению спор и пр. Некоторые бактерии окрашиваются по Цилю-Нильсену (микобактерии), а остальные - по Граму.
Среди бактериевидных следует особо выделить микоплазмы. Микоплазмы отличаются отсутствием клеточной стенки. Это мелкие, Грам (-) бактерии (0,12-0,25 нм), содержащие трехслойную ЦПМ. Они чувствительны к осмотическому давлению и нечувствительны к пенициллинам, ввиду отсутствия пептидогликана. Микоплазмы полиморфны. Имеют 92 вида, часть из них патогенны для человека.
Бактериевидные вызывают множество разнообразных заболеваний у человека:гнойно-воспалительные, дизентерию, сальмонеллезы, пневмонии, сибирскую язву, чуму, дифтерию, коклюш и др.
Вибриоспировидные. Это подвижные бактерии, имеющие извитую и спиралевидную формы. В мазках имеют несколько морфологических форм: извитые - четверть витка спирали, спириллы - в виде нескольких крупных завитков спирали, спирохеты - имеющие несколько мелких витков спирали. Извитые имеют один жгутик (Vibrio cholerae).
Таблица 8.
Морфологические признаки спирохет
| Род | Количество завитков | Характер движения | Окраска по Рома- новскому-Гимзе |
| Borrelia | 3-10 крупных, неравном. | толчкообразные, сгибате- льные, поступательные | сине-фиолетовые |
| Treponema | 8-14, среднекрупных | плавное, сгибательное, вращательное, поступательн. | бледно-розовые |
| Leptospira | Многочисленные первич- ные, S-образные, вторичн. | активное вращательно- поступательное | розово-сиреневые |
Спирохеты в зависимости от количества и формы завитков подразделяют на три формы:трепонемы – имеют до 14 средне-крупных завитков, лептоспиры - множество мелких завитков, боррелии – 3-10 крупных, неравномерных завитков.
Среди вибриоспировидных встречаются виды бактерий, проявляющие патогенные свойства в отношении людей: вызывая боррелиозы, лептоспирозы, сифилис, холеру и пр.
Вирусовидные. Это внутриклеточные генетические паразиты. Внеклеточную форму вирусов называют вирионом. Они имеют палочковидную или сферическую форму, проходят через бактериальные фильтры. Размеры варьируют от 15 до 500 нм. К вирусовидным относят разнообразные вирусы, в том числе – дефектные вирусы. Все вирусы делят на семейства и подсемейства и роды. Патогенные для человека и животных вирусы составляют 20 семейств. Вирусы делят на РНК и ДНК содержащие. Вирусы - это одна из мельчайших форм существования жизни. Они являются паразитами не только животного и растительного миров, но и микрофлоры, включая вирусы. На сегодня самая маленькая инфекционная частица - прион. Это белковая частица, которая не имеет генетического материала, но проявляет инфекционные свойства. Заболевания у человека и животных, вызываемые прионом, поражают мозг, с обязательным смертельным исходом.
Мицелиевидные. Это огромная группа, объединенная на основе общности многих признаков и образа жизни. Мицелий у микроорганизмов этой группы бывает воздушный и субстратный. Представители группы делятся на две неравноценные подгруппы: грибы и актиномицеты (таблица № 9).
Таблица 9
Морфологические признаки некоторых грибов
| Род | Мицелий | Споры | ||
| вегетативный | репродуктивный | тип | расположение | |
| Mucor | несептированный | спорангиеносец | эндоспоры | в спорангии |
| Aspergillus | септированный | конидиеносец | экзоспоры-конидии | в виде лейки |
| Penicillum | септированный | конидиеносец | то же | в виде кисточки |
Актиномицеты имеют вид длинных несептированных гиф, не образуют спор и жгутиков.
Грибы бывают низшие и высшие. Имеют дифференцированное ядро, способны к половому и бесполому видам размножения.
Среди этой группы имеются виды, патогенные для людей. Актиномицты вызывают у восприимчивых людей актиномикоз, а грибы - микозы.
Протистовидные. Это многочисленная группа одноклеточных микроорганизмов, распространенных в природе. Они могут быть шаровидной, овальной, сплюснутой или разветвленной формы, размером 5-20 мкм. Обычно подвижные и пластичные, образуют цисты в неблагоприятных условиях. Наиболее широко распространены жгутиконосцы, саркодовые, инфузории реснитчатые. Среди саркодовых имеются амебы раковинные и голые.
Протистовидные имеют виды, патогенные для человека, вызывая, например, амебную дизентерию.
Способ измерения микробной клетки
Микроскопические объекты измеряют в нанометрах (нм) или в микрометрах (мкм). В 1 мкм содержится 1000 нм, в 1 мм содержится 1000 мкм. Для измерения клеток применяют окуляр-микрометр и объект-микрометр. Окуляр-микрометр - это стеклянная пластинка в окуляре, на которой в центре нанесена шкала с 50 делениями. Объект-микрометр - это стекло, в центре которого находится шкала, поделенная на 100 частей. Обычно каждое деление шкалы содержит 10 мкм.
Объект-микрометр устанавливают на предметный столик, передвигая который винтами совмещают одно из делений с одним из делений окуляра-микрометра. Отмечают число делений объект-микрометра, в которые укладывается полное число делений окуляр-микрометра. Этим устанавливается величина делений окуляр-микрометра. Заменяют объект-микрометр на исследуемый препарат, размеры которого определяют линейкой окуляр-микрометра.
Структура микроорганизмов
Клетки микроорганизмов имеют внутренние и поверхностные структуры, среди которых различают обязательные и встречающиеся только у определенных групп микробов.
Строение бактериальной клетки. К внутренним широко распространенным структурам относят: цитоплазму, генофор, включения, рибосомы. К внешним обязательным структурам относят ЦПМ и клеточную стенку (за небольшим исключением). Необязательными для многих микроорганизмов внутренними структурами являются волютиновые зерна и спора, а внешними - капсула, жгутики, пили и пр.
Генофор или нуклеойд.Он содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) в форме свернутого кольца. ДНК называют хромосомой по аналогии с эукариотами. Генофор основной носитель генетической информации в клетке. Состоит из набора генов, которые расположены в определенном порядке. Кроме ДНК в клетке могут находится плазмиды и др. внехромосомные генетические структуры.
Цитоплазма.Это внутренняя среда клетки, в которой располагаются генофор (ДНК), рибосомы, полисомы, включения, ферменты, плазмиды.
Рибосомы состоят из РНК и белка. Они участвуют в процессе синтеза белка.
Гранулы содержат запасные вещества. Гранулы волютина окрашивают по Нейссеру.
Клеточная стенка. Это внешняя структура клетки, имеет неодинаковое строение у разных групп бактерий. В зависимости от строения клеточной стенки микроорганизмов, они могут окрашиваться как грамотрицательные или грамположительные. Это определяется количеством пептидогликана и других составных клеточной стенки.
Цитоплазматическая мембрана. Обязательный внешний элемент бактерий. Отделяет цитоплазму от клеточной стенки. Имеет трехслойную структуру. Это белково-липидный комплекс. ЦПМ полупроницаема и регулирует транспорт веществ в бактериальную клетку. Участвует в образовании мезосом. Это важный элемент клетки.
Споры.Это тельца сферической или эллипсойдной формы, устойчивые к воздействию неблагоприятных факторов, образуемые некоторыми бактериями. Их называют бациллами. Споры образуют такие роды как Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, отдельные кокки и спириллы. Спорообразование начинается, когда микробы испытывают недостаток в питательных веществах. Споры сохраняются в таких условиях, когда вегетативные клетки гибнут. В благоприятных условиях спора вновь может прорастать в вегетативную клетку, т.к. содержит генетический материал. Споры окрашивают по Ожешко.
Жгутики.Структурный элемент, предназначенный для движения бактерий в жидких средах. Бактерии могут иметь один жгутик и их называют монотрихии (Vibrio cholerae), один пучок жгутиков на одном конце - лофотрихии, по пучку жгутиков на обоих концах клетки - амфитрихии, множество жгутиков вокруг клетки - перетрихии. Жгутики окрашиваются по методу Леффлера.
Фимбрии.Внешний структурный элемент, короче и тоньше жгутиков, которые в большом количестве окружают клетку как "бахрома". Выполняют роль факторов адгезии, прикрепляясь к определенным рецепторам других клеток.
Пили.Внешний структурный элемент. В зависимости от функции и структуры, пили поделены на несколько типов. Пили 1, 3 и 4 типа функционируют как факторы адгезии. Более длинные пили, со структурой полого цилиндра, участвуют в переносе генетического материала от одной бактериальной клетке к другой.
Капсула.Является внешним структурным элементом. Это сложный комплекс таких соединеиий как полисахариды и полипептиды. Капсула не окрашивается анилиновыми красителями. Она не препятствует проникновению в клетку питательных веществ, являясь защитным слоем для клетки. Капсула препятствует фагоцитозу бактерий. Для обнаружения капсулы мазок окрашивают по комбинированному методу Гинса-Бури.
Вирусы.Это ультрамикроскопические облигатные внутриклеточные паразиты. Они были открыты в 1892 г Д.М. Ивановским. Вирусы содержат нуклеиновые кислоты одного из двух типов (ДНК или РНК). Нуклеиновая кислота окружена чехлом из белков, называемых капсидом.Структурный элемент, состоящий из белков и нуклеиновой кислоты, называют нуклеокапсид. Капсомеры - комплекс капсида и вирусного генома. Они скомпонованы по двум типам симметрии: сферической и спиралевидной. Некоторые вирусы на поверхности имеют шипы, образованные белками - гемагглютининами и нейраминидазой. Вирусы окрашивают по Морозову.
Актиномицеты. Клетки актиномицет имеют те же структурные элементы, что и бактерии: клеточную стенку, ЦПМ, в цитоплазме содержится нуклеойд, рибосомы и пр. элементы. Основным морфологическим признаком актиномицетов является ветвящаяся форма клеток, имеющих вид коротких палочек или длинных нитевидных образований, напоминающих мицелий грибов. Мицелий бывает у актиномицетов субстратным или воздушным.
Размножение актиномицетов происходит вегетативным путем (обрывками мицелия) и спорами. Спороносцы актиномицетов бывают волнистыми, прямыми и спиральными.
Среди актиномицетов встречаются сапрофитные и патогенные виды. Почвенные виды актиномицетов продуцируют многочисленные антибиотики.
Грибы.Имеют микро- и макроскопическое строение. Длинные нити - гифы, которые переплетаясь, образуют мицелий. Споры грибов располагаются внутри мицелия или внутри его. Плодоносящие гифы грибов Aspergillus и Penicillum называют конидиеносцами. Аскоспоры находятся в асках - сумках. Бластоспоры образуются в результате почкования клетки. Среди грибов различают высшие и низшие. Считают, что известных грибов более 500000 видов.