Желточно-солевой агар
а) Агар мелко измельчают (1,8-2,0 г), добавляют 100 мл дистиллированной воды, рН 7,1-7,2, прогревают до расплавления агара, остужают до 500 С.
б) Соблюдая правила асептики, вносят 20 % желточную взвесь (желток, асептически извлеченный из куриного яйца, взбалтывают в 200 мл изотонического раствора хлорида натрия).
в) Взвесь смешивают, разливают по 20 мл в чашки Петри. Хранят в холодильнике до употребления (две недели). Используют как элективную среду для выделения стафилококка.
3. Среда Китта-Тароцци
Бычью печень или другие органы (можно плаценту) нарезают мелкими кусочками, заливают трехкратным количеством МПБ, рН 7,4-?,6, кипятят 30 мин. Бульон фильтруют, а печень промывают водопроводной водой, просушивают с помощью фильтровальной бумаги. Распределяют по пробиркам по 3-4 г печени и по 7-8 мл МПБ. Стерилизуют 30 мин при 1 атм. Применяют для выделения анаэробов.
Элективными являются среды для первичного выделения энтеробактерий:Плоскирева (угнетает рост многих бактерий, способствует росту сальмонелл и шигелл), Эндо (различает лактозо (+) и лактозо (-) бактерии кишечной группы), висмут-сульфит агар (элективен для сальмонелл, ингибирует рост других бактерий) и пр.
Среда П-2.
Применяется для выделения протея. В 100 мл растопленного 2 % агара добавляют 3 мл дрожжевого экстракта, 1 г маннита, 1 г мальтозы, 0,8 г желчных солей, 0,2 г цитрата железа аммонийного, 0,05 г гипосульфата натрия, 2,5 г/мл 0,01 % раствора кристаллического фиолетового, 0,5 мл щелочного раствора фенолового красного, рН 7,4-7,7. Стерилизуют при 0,5 атм 15 мин. Добавляют 10-12 тыс ЕД полимиксина М. Разливают в чашки Петри. Среда имеет красно-коричневый цвет.
Для выделения многочисленной группы энтеробактерий после элективно-диагностических сред применяют дополнительные элективно-диагностические среды. Этими средами являются:
1. Среда Олькеницкого.
а) Соль Мора (0,2 г) и гипосульфат предварительно растворяют в дистиллированной воде в пробирках. Отдельно растворяют три углевода (лактозы, сахароза, глюкоза по 1 г) и мочевину (10 г) в колбе на водяной бане.
б) Все ингредиенты добавляют к расплавленному агару, размешивают и фильтруют через стерильную марлю, устанавливают рН 7,2-7,4, вносят индикатор (фиолетовый красный - 0,1 г, вода дистиллированная 25 мл), разливают в пробирки по 5-6 мл.
в) Стерилизуют при 0,5 атм 20 мин, охлаждают в скошенном положении, для получения столбика высотой 2,5 см и косяка - 4 см. Готовая среда бледно-розового цвета.
2. Среда Ресселя.
Среда предложена для определения у микробов ферментов, расщепляющих лактозу и глюкозу, с применением индикатора Андреде. Среда содержит МПА, к которому добавлены 2 % лактозы и 1 % глюкозы и 2 % реактива Андреде. Среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Разливают по пробиркам и скашивают, чтобы столбик был снизу, а сверху – косяк. Посев в среду проводят уколом в столбик и затем штрихом по косяку. Расщепление микробами только глюкозы окрашивает столбик среды. При расщеплении лактозы краснеет весь столбик и косяк, потому, что ее больше. В случае газообразования появляются пузырьки газа или разрыв среды. Применяют среду для дополнительной дифференциации бактерий кишечной группы.
4. Среда Клиглера.
Среда коммерческая, производства НИИИВС им. Мечникова (г.Петрово-Дальнее).
Дифференциально-диагностические среды.
1. Среды Хисса:
К 1 % пептонной воде добавляют 0,5 % раствор одного из углеводов (глюкоза, лактоза сорбит, маннит и пр.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в 1 н растворе NaOH). Среды разливают по пробиркам, содержащим поплавки (трубка 3 см с одним запаянным концом) для улавливания газообразования при разложении углеводов. Стерилизацию проводят текучим паром. Среды бесцветны, рН 7,2-7,4. При сбраживании углевода среда должна приобретать красный цвет.
2. Среда с мочевиной Кристенсена.
К 100 мл дистиллированной воды добавить пептон 0,1 г, хлорида натрия -0,5 г, калия динитрофосфата - 0,2 г, агара- 2 г, глюкозы- 0,1 г, фенолового красного 0,2 % - 0,6 мл, 10 мл 20 % мочевины.
Пептон, соль, агар растворить при нагревании, установить рН 6,8-6,9, профильтровать, стерилизовать при 1150 С текучим паром 1 ч, охладить до 500 С. Раствор мочевины асептично добавить к основе. Среду разлить в пробирки, охладить и скосить. При положительном результате среда становиться красной, при отрицательном результате на уреазу - остается желтой.
3. Среды для определения декарбоксилаз, лизина, аргинина, орнитина.
К 40 мл мясной воды добавить 0,5 г пептона, глюкозы- 0,1 г, дистиллированной воды - 60 мл, 1 мл 1,6 % спиртового раствора бромтимолового синего, L-аминокислоты- 2 г или DL-аминокислоты, дрожжевого экстракта - 0,3 г. В воде растворить белковую питательную основу и глюкозу. Установить рН 6,0-6,1. Разделить среду на 4 равных части. В каждую из трех порций внести одну из перечисленных аминокислот, четвертая порция - контроль.
Среды кипятят 5-10 мин, установить вновь рН 6,0-6,1, прибавить индикатор и разлить в пробирки по 2- мл. Стерилизовать при 0,5 атм 15 мин. При расщеплении аминокислот цвет среды из желтой изменится в синий. В контроле - цвет желтый.
3. Среда Кларка.
а) Ингредиенты: пептон - 5,0 г
глюкоза - 5,0 г
калий фосфат двузамещенный - 5,0 г
б) Растворяют все ингредиенты в небольшом количестве дистиллированной воды (80-100 мл) при подогревании на водяной бане в течение 29-30 мин. Затем их охлаждают до 200 С, фильтруют, доводят дистиллированной водой до 1000 мл, разливают в пробирки по 5 мл. Стерилизуют дробно текучим паром три дня подряд.
в) К суточной культуре на среде Кларка добавляют равный объем 20 % раствора едкого калия. Встряхивают и помещают в термостат при 370 С в наклонном положении. Учет проводят через 3-4 ч и на следующий день. При положительной реакции верхний слой жидкости окрашивается в оранжево-розовый цвет. При отрицательном результате - окраска остается неизменной. С помощью метода определяется наличие у микробов ацетилметилкар-бинола-ацетоина.
Существует очень много других сред относящихся к элективным, дифференциально- диагностическим и др., которые невозможно привести в данном разделе.
Бактериологический контроль питательных сред
Все серии питательных сред, изготавливаемые промышленным или лабораторным способами, необходимо контролировать по нескольким основным свойствам:
1. заданные цвет, консистенция, влажность, прозрачность,
2. ростовые свойства - скорость роста бактерий на среде, воспроизводимость, пышность роста и пр.
3. элективность - воспроизводимый рост необходимых бактерий, при исключении роста остальных,
4. ингибирование - воспроизводимое отсутствие роста посторонней микрофлоры.
Питательные среды должны давать рост бактерий (количество колоний, размер их, цвет и пр.), в соответствии с культуральными свойствами. Контроль питательных сред должен проводится с помощью тест-систем - типовых или местных штаммов бактерий. Исходная взвесь тест-культуры для контроля составляет 1 млрд бактерий в 1 мл.
Чувствительность сред определяется максимальным посевным разведением культур из исходной взвеси, которое дает максимальный рост бактерий на всех чашках. Скорость роста устанавливается по минимальному времени инкубации посевов в часах, в течение которого обеспечивается формирование четких видимых невооруженым глазом колоний бактерий.