Занятие 11
Генетика микроорганизмов. Медицинская биотехнология.
Генетическая инженерия
Студент должен:
• знать:
- фенотипическую и генотипическую изменчивость микроорганизмов;
- мутации; генетические рекомбинации у бактерии: трансформацию, трансдукцию, коньюгацию;
- плазмиды;
- основные направления медицинской биотехнологии;
- методы генетической и клеточной инженерии, их использование в диагностике и лечении; получение лечебных, профилактических и диагностических препаратов;
- методы картирования генов;
- принципы получения интерферона, инсулина методами генной инженерии и МКА с помощью гибридомной технологии;
• уметь:
- проводить и учитывать результаты опытов трансдукции, трансформации, коньюгации;
- владеть методами молекулярной гибридизации, полимеразной цепной реакции.
Вопросы для проверки исходного уровня знаний
1. Организация генетического аппарата у бактерий. Бактериальная хромосома и плазмиды. Генотип и фенотип.
2. Мутации спонтанные и индуцированные. Каков молекулярный механизм мутаций? Какие вы знаете мутагены?
3. Что такое ауксотрофы? Как получают ауксотрофные штаммы бактерий?
4. Генетические рекомбинации. Что такое трансформация?
5. Трансдукция. Какими свойствами обладает трансдукцирующий фаг? Трансдукция специфическая, неспецифическая, абортивная.
6. Что такое коньюгация бактерий? Как она осуществляется? Основные функции F-фактора.
7. Понятие о внехромосомных носителях генетической информации. Плазмиды. Классы плазмид.
8. Типы генетического контроля лекарственной устойчивости у бактерий? Какими свойствами обладают R-плазмиды?
9. Что такое бактериоцины? Гены, детерминирующие бактериоциногенность. Каковы основные свойства Col-плазмид?
10. Основные направления развития медицинской биотехнологии.
11. Проблемы конструирования клетки с новыми свойствами. Селекция микроорганизмов-продуцентов биологически активных веществ.
12. Методы генетической инженерии. Получение интерферона, инсулина, гормона роста, интерлейкинов, субьединичных вакцин.
13. Метод цепной полимеразной реакции (ПЦР).
14. Клеточная инженерия. Гибридомная технология и получение моноклональных антител (МКА).
15. Способы картирования бактериальных хромосом и плазмид.
16. Проблемы создания новых лекарственных форм. Иммобилизации антибиотиков на липосомах.
Самостоятельная работа студентов
Задание 23. Рассмотреть S- и R-колонии на демонстрационных чашках.
Описание представить в тетрадях.
Задание 24.Генетические рекомбинации у бактерий:
- коньюгация: постановка опыта скрещивания Нfr × F у кишечной палочки (демонстрация);
- специфическая трансдукция: постановка опыта передачи локуса “gal” с помощью умеренного фага «лямбда» у кишечной палочки (демонстрация);
- трансформация: демонстрация опыта передачи устойчивости к стрептомицину у Bacillus subtilis;
- плазмиды: демонстрация электронограмм различных плазмид;
- результаты продемонстрированных опытов с описанием и объяснениями представить в тетрадях.
Методические указания к выполнению работы
Рассмотреть рост колоний биохимических мутантов на демонстрационных чашках.
Ауксотрофные мутанты – биохимические мутанты, требующие присутствия в питательной среде факторов роста (аминокислот, витаминов), в которых не нуждаются клетки исходного (дикого) типа, называемые прототрофами.
Прототрофы способны размножаться на полноценных средах, но не могут расти на минимальных. Для того, чтобы ауксотрофный мутант размножался на минимальной среде, в нее должен быть добавлен фактор роста (или несколько различных факторов), в которых данный ауксотроф нуждается, поскольку сам не может синтезировать.
Для получения ауксотрофных мутантов с помощью «пенициллинового» метода на исходную (прототрофную) культуру воздействуют мутагенными факторами – ультрафиолетовыми лучами или химическими мутагенами. Затем обработанную таким образом культуру выращивают в полноценной среде, в которой размножаются как прототрофные, так и ауксотрофные клетки. Размножившиеся бактериальные клетки отмывают и переносят в минимальную среду с добавлением пенициллина, где могут размножаться только клетки-прототрофы. Под действием пенициллина эти растущие клетки погибают. Ауксотрофные мутанты не способны к делению на минимальной среде.
Для проверки на ауксотрофность колонии высевают паралельно на минимальные и полноценные среды (удобно пользоваться методом «реплик»). Выделенные ауксотрофы идентифицируют, т.е. определяют необходимый фактор роста.