Определение фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов
1. Для получения нейтрофиловмышам вводят внутрибрюшинно 3-4 мл 2-3% раствора пептона и через 2 ч животных умерщвляют с помощью хлороформа. Их вскрывают в асептических условиях. Из брюшной полости с помощью шприца или пастеровской пипетки отсасывают жидкость, переносят ее в силиконизированные центрифужные пробирки.
2. После центрифугирования пробирок в течение 10 мин при 1000 об/мин осадок ресуспендируют в среде 199, подсчитывают число клеток в камере Горяева и доводят до концентрации 1-2х106/мл.
3. К клеткам добавляют равный объем бактерий (чаще всего Staphylococcus aureus, не содержащий белка А) или опсонизированного зимозана в соотношении 1:10 и инкубируют при 37 °С в течение 30 мин.
4. Бактерии предварительно должны быть опсонизированы мышиной сывороткой. Опсонизацию проводят в течение 10 мин при температуре 37 °С с последующим отмыванием.
5. После инкубации готовят мазок на предметном стекле, фиксируют его метанолом 20 мин и красят краской Романовского-Гимзы в течение 30-40 мин.
6. Учет результатов осуществляется микроскопически. В мазке при увеличении х90 с иммерсионной системой подсчитывают фагоцитарный индекс (процент фагоцитирующих нейтрофилов) и фагоцитарное число (количество поглощенных бактерии на 1 нейтрофил).
Для изучения фагоцитарной активности макрофаговна 3-4-е сутки после введения раствора пептона мышей умерщвляют (в соответствии с современными нормами биоэтики), вскрывают в асептических условиях и вводят внутрибрюшинно 5-8 мл среды 199, содержащей 10% сыворотки эмбриона коровы. После легкого массажа брюшной полости жидкость отсасывают. Полость можно промывать средой 199 несколько раз, объединяя в одну все полученные порции. Далее исследование ведется так же, как опыты с нейтрофилами (рис. 3.3, см. также цв. вклейку).
Рис. 3.3.Фагоцитоз зимозана макрофагом (конфокальная микроскопия и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия): а - интактный макрофаг; б - макрофаг, захвативший зимозан (красный)