Адсорбційна хроматографія
Як вже зазначалось, у методі адсорбційної хроматографії розділення речовин базується на різниці у ступеню адсорбції певних речовин адсорбентом та розчинності їх у відповідному розчиннику.
При адсорбції взаємне притягування молекул адсорбенту та речовини, яка адсорбується, обумовлене не валентними зв’язками, а відбувається за рахунок водневих зв’язків, сил міжмолекулярної взаємодії. На поверхні адсорбенту є багато центрів зв’язування молекул чи йонів речовин, що адсорбуються, наприклад, ділянки, збагачені електронами, бідні на електрони (заряджені позитивно), неполярні та ін. Такі центри зв’язування здатні фіксувати молекули розчинених речовин, причому кожна активна ділянка може взаємодіяти тільки з однією молекулою речовини, яка адсорбується. Після утворення мономолекулярного шару адсорбованої речовини на поверхні адсорбенту швидкість адсорбції буде пропорційною концентрації речовини та частки незайнятих активних ділянок. Між процесами адсорбції та десорбції встановлюється рівновага, яка описується ізотермами адсорбції та може бути трьох типів – опуклою (L-ізотерма), ввігнутою (S-ізотерма) та лінійною (C-ізотерма). Ізотерму адсорбції можна вважати лінійною тільки в разі незначного завантаження колонки або шару, що відповідає першочерговому зв’язування центрами, які мають більшу спорідненість, а додаткові кількості розчиненої речовини при цьому зв’язуються слабкіше.
Чим міцніше зв’язування речовини на поверхні адсорбенту, тим повільніше рухається речовина вздовж колонки, наповненої адсорбентом. З іншого боку, кількість зв’язаної речовини не постійна, а зменшується із зменшенням концентрації. Отже, молекули можна розділити тільки тоді, коли їх адсорбція описується різними ізотермами, оскільки в цьому випадку у них буде різний ступінь зв’язування. Ізотерма адсорбції характерна для конкретної молекули речовини, що адсорбується, і адсорбенту.
В адсорбційній хроматографії як адсорбенти використовуються полярні речовини (оксиди Алюмінію, Магнію, Кальцію, ферум(ІІІ) сульфат та магній карбонат, кальцій гідроксид, вуглеводи та ін.), а також неполярні (активоване вугілля, деякі смоли). На полярних адсорбентах енергія адсорбції тим більша, чим більша полярність або ненасиченість речовини, що адсорбується, а на неполярних адсорбентах енергія адсорбції зростає зі збільшенням розмірів молекул речовини, що адсорбується. Відповідно до енергії адсорбції й одержують окремі фракції з колонки.
В адсорбційній хроматографії для розділення речовин в нейтральних та лужних розчинах частіше застосовують активований алюміній оксид як адсорбент, а для розділення речовин в кислих розчинах як адсорбент застосовують здебільшого силікагель.
Як вже зазначалось, чим вища полярність молекул речовини, що адсорбується, тим більша міцність зв’язування її з полярним адсорбентом. Тому суміш полярних речовин, що розділяються, краще вносити в малополярний розчинник, а промивати колонку розчинником з високою полярністю.
Важливе значення в адсорбційній хроматографії має правильний вибір розчинника. Вибирають розчинник, який добре розчиняє всі компоненти суміші, які треба розділити, мінімально адсорбується на адсорбенті, не вступає в хімічні реакції з речовинами, що розділяються, а також з адсорбентом.
Методом адсорбційної хроматографії макро- та напівмікрокількості речовин розділяють в основному на колонках, рідше – в тонкому шарі.
Колонка для адсорбційної хроматографії являє собою скляну трубку з відтягнутим нижнім кінцем або бюретку завдовжки 20-30см та діаметром 8-12мм. Колонка заповнюється суспензією адсорбенту у тому розчиннику, який буде використаний для хроматографування. Після заповнення колонки адсорбентом зверху твердої фази вміщують тампон із скловати для попередження змучування адсорбенту.
На нерухому фазу наноситься невеликий об’єм розчину суміші речовин, які треба розділити, так, щоб розчин пройшов у верхній шар адсорбенту. Цей прийом називається завантаженням колонки. Якщо швидкість проходження розчинника дуже мала, то колонку прилаштовують до колби Бунзена та створюють розрідження у колбі за допомогою вакуум-насоса.
При проходженні крізь колонку розчинника (рухомої фази) хроматограма проявляється, тобто у процесі елюювання колонки відбувається розділення суміші речовин. Рідина, яка виходить з колонки (елюат), збирається у вигляді окремих фракцій за допомогою автоматичного колектора фракцій. Потім кожна фракція досліджується хімічними, фізико-хімічними методами для виявлення її якісного та кількісного складу.
Хроматографія в тонкому шарі в залежності від характеру речовин, які треба розділити, завдань розділення може бути адсорбційною, розподільною, йонообмінною, молекулярно-ситовою.
У порівнянні з хроматографією на колонці чи на папері тонкошарова хроматографія має набагато вищу роздільну здатність і швидкість розділення, більшу точність, технічно не складна. Цей метод дає можливість досліджувати органічні та неорганічні речовини в дуже малих кількостях (від 0,1 до 0,005 мкг). Це обумовлено тим, що у разі застосування сорбенту з розміром частинок менше 0,1мм, значно збільшується співвідношення поверхня/об’єм, а отже, збільшується активна поверхня сорбенту, а також у цьому методі має місце надзвичайно високе співвідношення маси речовин і маси сорбенту – 1:1·103-1:1·104.
У тонкошаровій хроматографії нерухомою фазою є тонкий шар сорбенту (0,25-0,5 мм), який рівномірно наноситься на поверхню скляної або алюмінієвої пластинки.
Сорбентом можуть бути неорганічні та органічні речовини – оксиди Алюмінію, Магнію, Кальцію, магній силікат, силікагель, целюлоза, ДЕАЕ-целюлоза, поліаміди та ін. Ці матеріали потрібно подрібнити до високого ступеня дисперсності. Адсорбент спеціальним аплікатором, вальцем або скляним стрижнем наноситься на пластинку у вигляді кашоподібної суспензії у визначеному розчиннику. Інколи для кращої фіксації адсорбента застосовують клеючі речовини (крохмаль, гіпс, колодій, розчин ацетилцелюлози в ацетоні та ін.).
Для тонкошарової хроматографії доцільно застосовувати пластинки промислового виробництва на основі алюмінієвої фольги – фіксіон або силуфол. Бувають фіксіони, що містять катіонообмінні шари в натрієвій формі та аніонообмінні шари в ацетатній формі. Із силуфольних пластинок найпоширенішою є пластинка на основі силуфолу УФ254 з люмінесцентним індикатором для довжини хвилі опромінення 254нм.
Якщо пластинка була виготовлена безпосередньо дослідником, її спочатку треба добре висушити. На висушену пластинку наносять розчин суміші досліджуваних речовин на відстані 2-2,5см від краю пластинки у вигляді стартової точки чи стартової лінії. На дно скляної камери наливають відповідний розчинник, занурюють край пластинки нижче стартової лінії у розчинник, герметизують камеру скляною кришкою. Відбувається проявлення хроматограми. Рухаючись у шарі адсорбенту за рахунок капілярних сил, розчинник переміщує з різними швидкостями компоненти досліджуваної суміші. Коли розчинник підніметься майже до краю пластинки, фіксують фронт розчинника – його верхній рівень на пластинці.
Положення плям речовин, які розділяються, на хроматограмі визначають за забарвленням, флуоресценцією, а також після обробки пластинки хімічними реагентами, які з досліджуваними речовинами утворюють забарвлені продукти реакції.
Положення плям характеризується значеннями Rf. Rf є відношення шляху, який пройшла речовина від старту до певного положення на хроматограмі, до шляху, який пройшов розчинник від старту до найвищого положення. Rf є індивідуальною характеристикою кожної речовини у даній системі розчинників і за даних умов, але залежить від багатьох побічних факторів. Тому хроматографування проводиться разом з відомими сполуками (стандартами), тобто чистими речовинами, вміст яких передбачається у досліджуваному розчині. У цьому випадку положення компонентів суміші, яку розділяють на хроматограмі, визначають порівнюючи положення певного компонента з положенням речовин-свідків.
Для підвищення ефективності розділення речовин застосовується двомірна хроматографія. Для цього суміш речовин спочатку розділяють в одному напрямку. Після першого проявлення хроматограму виймають з камери, висушують, а потім ставлять на друге проявлення в перпендикулярному до першого напрямку з тим же розчинником чи з іншим.
Тонкошарова хроматографія застосовується не тільки для аналітичних цілей, але і для отримання значних кількостей розділених речовин для подальшого їх використання. Для препаративної тонкошарової хроматографії пластинки покривають товстим шаром адсорбенту (до 5мм), а розчин суміші речовин, які розділяють, наносять у значній кількості у вигляді смуги вздовж одного з боків пластинки. Компоненти суміші розподіляються у вигляді смуг. Розділені компоненти після зскрібання адсорбенту відповідної смуги з пластинки елююють відповідним розчинником та виділяють з розчину для подальшого використання.