Способы исправления растворов
Базируются на расчете коэффициента (фактора) поправки. Коэффициент поправки — это число, которое показывает, во сколько раз данный раствор отличается от близкого к нему по концентрации точного раствора определенной нормальности (0,1 N, 0,01 N и др.).
Определение коэффициента поправки К дает возможность получить нужную концентрацию раствора добавлением к анализируемому воды или реактива. Коэффициент поправки чаще всего устанавливают по отношению объемов взаимодействующих точного определенной нормальности и испытуемого растворов.
СПОСОБЫ ОЦЕНКИ РЕЗУЛЬТАТОВ
КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Качество выполнения лабораторного исследования во многом определяется правильно выбранной и осуществленной методикой оценки полученных при работе с фотометрической аппаратурой результатов. Она базируется на использовании градуировочного графика (таблицы), факторов пересчета, а также формулы, учитывающей значения абсорбции (экстинкции) и концентрации стандартных проб, обрабатываемых параллельно с опытными в одинаковых с ними условиях.
1. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ПО КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ
Градуировочная (калибровочная) кривая отражает тесную зависимость между абсорбцией А, называемой также оптической плотностью D, экстинкцией Е (а в отдельных случаях, например, в процессе осуществления пламенной фотометрии, флюориметрии — интенсивностью излучения света) и концентрацией С вещества в сериях стандартных растворов (рис. 78).
Рис. 78. Схема построения калибровочной кривой
К построению калибровочной кривой можно приступить лишь после того, как будет достигнута уверенность в том, что метод лабораторного исследования достаточно хорошо отработан. В противном случае точность расчета по калибровочной кривой оказывается неудовлетворительной из-за неадекватности условий и техники обработки стандартных и опытных проб.
При построении градуировочного графика следует стремиться к тому, чтобы калибровочные растворы помимо стандартного вещества содержали если не все, то основные (сказывающиеся на течении реакции) компоненты биологической жидкости. Это достигается применением стандартных сывороток водных растворов, содержащих и другие ингредиенты плазмы, способные интерферировать с определяющими веществами, в количестве, примерно соответствующем таковому в исследуемой биологической жидкости. Так, при определении содержания билирубина в плазме (сыворотке) крови стандартные растворы должны содержать белок (альбумин), поскольку он не только предохраняет билирубин от окисления, но и усиливает интенсивность окраски получаемых в процессе реакции азопигментов. При определении концентрации ионов калия в плазме крови стандартные его растворы должны заключать в себе также ионы натрия и кальция (в концентрации, соответствующей содержанию этих ионов в анализируемой биологической жидкости), так как они влияют на интенсивность свечения ионов калия в пламени газовой горелки пламенного фотометра.
Стандартные растворы должны готовиться с особой тщательностью из навески, полученной на весах для очень точного взвешивания (аналитических и других). При этом следует обратить внимание на то, чтобы стандартные вещества строго отвечали своей химической формуле, имели высокую степень чистоты и достаточную стабильность, не были гигроскопичны и не взаимодействовали с газами воздуха. Навеска должна быть достаточно большой для уменьшения технической ошибки взвешивания. Последнему способствует взвешивание стандартного вещества не в обычном тяжелом (массивном) бюксе, а на листочке целлофана (либо полиэтиленовой пленки) с последующим количественно полным перенесением вещества в соответствующую стеклянную мерную посуду. Как правило, оно перед взвешиванием должно быть высушено до постоянной массы в сушильном шкафу при 110°С.
Используемую для получения стандартных растворов градуировочную мерную посуду нужно предварительно тщательно обезжирить и вымыть. Не рекомендуется сушить мерную посуду (в частности мерные колбы) в сушильном шкафу, так как при высокой температуре меняется ее объем и нарушается градуировка.
Построение калибровочной кривой начинается с приготовления арифметического ряда разведении с последующей обработкой стандартных растворов аналогично опытным пробам. В отдельных случаях стандартные вещества можно использовать на конечном этапе исследования, например, путем их нанесения на электрофореграмму (либо хроматограмму), что несколько усложняет расчет результатов и привносит погрешность за счет неучтенных потерь анализируемого вещества в процессе его выделения (экстракции и других процедур).
Разведения стандартного вещества должны охватывать диапазон физиологических концентраций и выходить за пределы их минимальных и максимальных величин (до значений, могущих иметь место при встречающихся формах патологии). Так, например, при исследовании содержания общего белка в сыворотке (плазме) крови концентрация стандартного вещества (альбумина) должна быть в интервале от 40 до 120 г/л (при физиологической концентрации общего белка 65—85 г/л).
В большинстве случаев ряд калибровочных растворов получают путем разбавления основного, маточного раствора (как это имеет место, например, при определении содержания общего белка плазмы или сыворотки крови). Известно, что чем концентрированнее раствор стандартного вещества, тем оно дольше сохраняется в нем. Многие низкомолекулярные соединения (гистамин, серотонин) допускают возможность хранения их растворов в замороженном состоянии. После оттаивания из основного раствора стандарта нередко делают промежуточные разбавления (одно или несколько).
Для каждой рабочей концентрации стандартного вещества нужно сделать 3—5 фотометрических или других (например денситометрических) определений. Всего используют 2—3 серии окрашенных растворов, в результате чего обычно выполняется 6—12 исследований каждого рабочего разведения стандарта.
Суть построения градуировочной кривой сводится к тому, что определенные объемы растворов серии стандартных проб обрабатываются в условиях, полностью идентичных таковым при анализе исследуемого материала (опытных проб).
Измерения оптической плотности начинают со стандартного раствора наименьшей концентрации. Усредненные (соответствующие отдельным концентрациям) значения оптической плотности (абсорбции, экстинкции) наносят на миллиметровую (калибровочную) бумагу. На оси абсцисс (горизонтальной) с соблюдением одинаковых интервалов в равномерно возрастающей концентрации откладывают показатели содержания вещества в стандартном растворе; на оси ординат (вертикальной) — соответствующие им величины абсорбции. Зависимость между двумя сопоставляемыми величинами отражается линией, построенной уже по трем точкам замера. Однако строить калибровочный график следует не менее чем по пяти точкам. Калибровочная кривая прокладывается (тонко отточенным карандашом, желательно с помощью прозрачной линейки) таким образом, чтобы по возможности большее число точек (например 3 из 5) лежало на линии, а остальные располагались близ нее, равномерно отклоняясь в ту и другую стороны. Отдельные точки, значительно смещающиеся от калибровочной кривой и обычно являющиеся результатом грубой ошибки в определении, исключаются из учета. Точки принято обозначать крестиками (точка не имеет ширины). Оси координат изображают в виде толстых («жирных») отрезков прямой (со стрелками), на их фоне калибровочная кривая должна представлять собой тонкую линию.
Расположение кривой определяют так, чтобы она исходила из нулевой отметки под углом ~ 45° к осям координат, при этом достигается наибольшая точность измерений, чему способствует также выбор оптимального, достаточно крупного масштаба. В правом верхнем углу калибровочного графика приводят: наименование калибровочной кривой, ссылку на метод исследования (например: «РАР» метод определения содержания глюкозы в сыворотке крови), номер светофильтра (или его конкретную физическую характеристику — максимум пропускания), длину оптического пути кюветы (в мм), дату построения кривой. При этом учитывают, что у большинства обычных фотоэлектроколориметров наиболее благоприятная область измерений лежит в пределах значений абсорбции 0,1—0,3 (максимум до 0,7).
Чтобы правильно построить калибровочную кривую, необходимо знать, какие условия оказывают влияние на расположение линии в системе координат.
Если абсорбция опытной пробы оказывается не скорригированной на экстинкцию контрольной, то часто не удается достигнуть совпадения нулевого значения оптической плотности с нулевым значением концентрации. Методы с таким построением калибровочного графика не рекомендуются для использования в клинико-диагностических лабораториях.
Известен ряд причин, вызывающих нарушение прямо пропорциональной зависимости между абсорбцией и концентрацией вещества в растворах. К ним относятся:
1) присутствие в среде посторонних электролитов, вызывающих деформацию молекул или комплексных ионов окрашенных веществ;
2) гидратация (сольватация), сказывающаяся на поглощении раствором светового потока: с изменением концентрации раствора этот процесс протекает неравнозначно;
3) неполное взаимодействие исследуемого вещества с реактивом при его разбавлении;
4) изменение взаимовлияния частиц при разбавлении раствора;
5) сдвиг рН раствора, влияющий на полноту образования и состав молекул окрашенного соединения;
6) изменение степени диссоциации вещества в растворе при разбавлении.
Основное значение в нарушении прямо пропорциональной зависимости между абсорбцией и концентрацией имеет то обстоятельство, что сопровождающаяся образованием окрашенного соединения химическая реакция протекает не строго стехиометрично, т. е. реакция не всегда бывает полной. Примером этому служит взаимодействие аммиака с реактивом Нессера.
Кроме причин, связанных с состоянием вещества в растворе, ряд физических факторов, в частности недостаточная монохроматизация светового потока, способны вызвать отклонения в прямо пропорциональной зависимости между оптической плотностью и концентрацией. В случае, если через абсорбируемый слой пропускается немонохроматический световой поток, то величина экстинкции может изменяться неравномерно с увеличением (уменьшением) толщины слоя раствора и концентрации вещества в нем, приводя тем самым к искривлению калибровочной линии.