Десорбция микроорганизмов при их количественном учете в почве

Для правильного количественного учета микроорганизмов в почвах необходимо вызвать три процесса: 1) разрушить почвен­ные агрегаты, 2) десорбировать почвенные микроорганизмы с твердых поверхностей, 3) разделить находящиеся в почве микроколонии на отдельные составляющие их клетки. Все три процес­са вызываются одинаковыми воздействиями, хотя очень трудно осуществить их полностью. Типы воздействия могут быть меха­ническими и химическими. Механические воздействия — это растирание, обработка почвенной суспензии на пропеллерной мешалке (миксер, микроизмельчитель тканей, магнитная мешалка), ультразвуковая (УЗ) обработка. Химические воздействия — это обработка щелочью или раствором пирофосфата натрия, кото­рый обладает щелочным действием, воздействие поверхностно­активными веществами (ПАВ), например додецилсульфатом нат­рия, обработка ферментами.

Наиболее эффективными оказались механические обработ­ки. Для учета бактерий методом посева или прямым микроско­пическим методом используют УЗ небольшой частоты и мощ­ности, так как в противном случае будут разрушены сами клетки. Собственно почвенные бактерии гораздо более устойчивы к УЗ, чем их лабораторные культуры. Существует такая закономер­ность: чем крупнее клетки, тем больше они разрушаются УЗ. Поэтому для грибов, как более крупных организмов УЗ доволь­но губителен и при учете грибов лучше применять пропеллерную мешалку, добиваясь разрушения почвенных агрегатов и дробления мицелия на однородные части длиной 15-30 мкм при сохранении ими жизнеспособности и целостности конидий и половых спор.

Если количественный учет микроорганизмов в почве прово­дится без тщательной предварительной подготовки почвенной суспензии, получают совершенно неверные результаты. Предва­рительная обработка почвенной суспензии повышает определяе­мое количество микроорганизмов в зависимости от типа и состо­яния почвы в 3-300 раз. Особенно сильный эффект получается для сухих оструктуренных почв. Малый эффект наблюдается для сильно увлажненных нижних минеральных горизонтов почв. При традиционном способе подготовки почвенной суспензии путем 10-минутного перемешивания почвенной суспензии в колбе мож­но получить, хотя и не абсолютные, но годные для сравнения результаты, например, для разных делянок одной и той же почвы одинаково увлажненных, но содержащих разные количества удоб­рений. Такое сравнение невозможно для почв разных типов или почвенных образцов из разных генетических горизонтов, а также для сравнения сухих и увлажненных почв. Часто делают вывод о том, что при высушивании почв клетки погибают, а они по край­ней мере частично переходят в адсорбированное состояние и не учитываются.

Если старый метод давал различие в содержании бактерий в разных типах почв в 2-3 раза, то с применением новых методов диспергирования почв и десорбции микроорганизмов оказалось, что эти различия достигают десятков и даже сотен раз.

2.3 Активность адгезированных клетокАдгезированные клетки находятся в специфической микрозо­не, образующейся на границе раздела жидкости и твердого тела, где адсорбируется большинство полимерных органических ве­ществ в том числе и гумус, происходит адсорбция гидролити­ческих ферментов. Поскольку большинство почвенных частиц заряжены отрицательно, здесь концентрируются положительно заряженные органические мономеры, повышается концентрация адсорбированных катионов (К, NH4 Са, Mg, Н), уменьшается концентрация неорганических и органических анионов (рис. 95). Активность адгезированных клеток по сравнению со свободны­ми часто резко изменяется. Она может быть больше или меньше, чем у свободных в за­висимости от того, окажутся ли условия в микрозоне на поверхности раздела более или менее благоприятными, чем в почвенном растворе. Обычно эта микрозона более благоприятная, так как адсорбированные гидролазы осуществляют гидролиз полимеров и появляются лег­кодоступные мономеры (сахара, аминокислоты, органические кислоты, спирты). Микробы лучше обеспечены минеральными питательными веществами в том числе фосфором и железом, которые также осаждаются на поверхности частиц. Автотрофные нитрификаторы используют преимущественно адсорбиро­ванный аммоний.

Однако на поверхности раздела жидкой и твердой фаз могут концентрироваться и токсичные вещества, такие как тяжелые металлы, антибиотики. Здесь может быть меньше отрицательно заряженных органических кислот или аминокислот и тогда адге­зированные микробы будут развиваться хуже. На поверхности раздела отрицательно заряженных частиц в кислых почвах будет более низкое pH из-за высокой концентрации ионов водорода, что также будет оказывать влияние на развитие микробов. Почвенные биохимики предложили молекулярный рН-метр для измерения pH на поверхности твердых частиц. На поверхности частицы адсорбируют фермент и затем определяют оптимальное pH для проявления его максимальной активности. Это осуществляется следующим образом. Находят оптимум pH действия фермента для двух растворов. В одном растворе фермент находится в свободном, в другом — в адсорбированном состоянии. Для адсорбированного фермента наблюдается «кажущийся» сдвиг в щелочную область. Он может достигать единицы pH и более. В действительности никакого сдвига рН-оптимума для адсорбированного фермента не происходит. Просто он находится в зоне с более низкими значениями pH. Доказано, что в этой зоне происходит изменение и концентрации, и активности ионов водорода. С помощью ферментов можно определять pH в микрозонах. Изменение pH на поверхности влияет не только на активность фермента, но и на активность адгезированных клеток. Фермен ты могут адсорбироваться различным образом. Фермент представляет собой белковую глобулу с активным центром, к которому подходит субстрат. Глобула имеет положительно и отрицательно заряженные, гидрофильные и гидрофобные участки. Поэтому на разных почвенных частицах адсорбция проходит раз­ными сторонами. Если закрывается активный центр, фермент теряет активность. Обычно при адсорбции изменяется конфор­мация (конфигурация) молекулы, что ведет к изменению актив­ности фермента, но он становится более устойчивым к воздей­ствию неблагоприятных факторов (высушивание, хранение, температурные воздействия и др.). Фермент может быть закрыт органоминеральным гелем или может попасть в межплоскостные пространства минералов типа монтмориллонита. Все это будет отражаться на его активности. Молекула субстрата может быть очень маленькой (Н202) или очень крупной, например, белковая молекула для протеазы (на рисунке обозначена чер­ными кружками).

Адсорбированные (иммобилизованные) ферменты в последние 30 лет широко применяются в биотехнологии. Однако, как обна­ружилось, природа использует эти механизмы уже миллиарды лет.

В настоящее время хорошо изучено влияние адсорбентов на различные типы брожений, на азотфиксацию, нитрификацию, использование кислых и основных аминокислот, окисление мета­на, водорода, использование некоторых углеводородов. Наиболее сильно влияние твердых частиц проявляется в разбавленных раст­ворах, каковым, в частности, обычно является почвенный раст­вор. Здесь микроорганизмы часто не могут развиваться в растворе из-за низкой концентрации питательных веществ, но на поверх­ности частиц они развиваются, так как здесь концентрация пита­ния оказывается гораздо больше. Это явление было подробно изу­чено водными микробиологами для олиготрофных водоемов. Влияние адсорбента может оказывать различный и даже прямо противоположный эффект в зависимости от взаимного рас­положения частиц адсорбента и клеток. В случае а на клетки будет оказывать влияние специфика поверхности раздела жидкости и твердого тела. В случае б адсорбент не будет оказы­вать непосредственного действия на клетки. В случае в клетки покрываются чехлом из коллоидных частиц гумуса или глинистых минералов и их окружение, влияющее на жизнедеятельность, будет особым. Четвертый случай г представляет собой заключение клеток внутри конгломерата из частиц. Часто активность клеток в таких условиях вообще невозможна.

Активность будет зависеть от плотности контакта с частицами. Показано 10 случаев более или менее плотного контакта клетки бактерии с почвенной частицей, покрытой пленкой из органического и минерального геля: от полного удаления от частицы до расположения на поверхности геля, внутри геля или на поверхности минеральной частицы. Поверхность минеральной частицы показана на рисунке черной линией, а органоминеральный слой окрашен в серый цвет. Клетки со стебельком, жгутиками, фимбриями, с капсулой или без нее будут располагаться в разных по свойствам микрозонах. Особое положение занимают клетки, погруженные в органоминеральный гель (собственно иммобилизованные клетки). Во многих случаях они вообще не могут делиться. Ясно, что в каждом случае микросреда для развития клетки будет разной, а клетка всегда развивается в микросреде.

Эффективный способ борьбы с прикрепившимися фитопатогенными микроорганизмами имеется у растительных и животных организмов. Если клетки прикрепились и нет возможности от них избавиться, корень или другой орган растения или животного сбрасывает клетки своего эпителия и таким образом освобождается от вредных микроорганизмов.

Жидкая фаза почвы

Жидкая фаза почвы (почвенный раствор) обычно располагается в капиллярах или образует пленки разной толщины. Капилляры и пленки могут быть значительно толще или тоньше клеток микроорганизмов. Сравнительно редко после дождей, полива или подъема уровня фунтовых вод в почве появляются большие объемы воды, которые движутся под действием сил гравитации. Для жидкой фазы почвы характерна микрозональность в отношении содержания газов, органических веществ, pH, Eh и др. На протяжении некоторого времени микрозоны могут различаться и по потенциалу влаги. Он может быть различным в тече­ние долгого времени в разных почвенных горизонтах

Жидкая фаза почвы всегда содержит некоторое количество минеральных, органических и органоминеральных веществ в молекулярном или коллоидном состоянии, а также растворен­ные газы. Однако концентрация питательных веществ в почвен­ном растворе обычно очень мала, и развитие микроорганизмов в объеме почвенного раствора происходит сравнительно редко. Они развиваются в адгезированном состоянии. Таким образом, глав­ная функция почвенного раствора заключается в переносе ве­ществ и обеспечении микроорганизмов водой. Снабжение пита­тельными веществами обычно проходит два этапа: 1) перенос питательных веществ с почвенным раствором на твердую поверх­ность и концентрирование на ней, 2) использование адсорбиро­ванных веществ адгезированными микробными клетками.

Почвенный раствор в сотни и тысячи раз менее концентриро­ван по сравнению с обычно применяемыми микробиологическими питательными средами, например средой Чапека, мясо-пептон- ным бульоном или крахмало-аммиачной средой. Отсюда возник­ла идея о необходимости применения при культивировании поч­венных микроорганизмов очень разбавленных питательных сред, особенно в тех случаях, когда исследователь хочет приблизиться к воссозданию естественной обстановки. В этих условиях удает­ся выделять и изучать олиготрофы. Микроорганизмы успешно развиваются в разбавленных питательных растворах и здесь их вырастает гораздо больше, чем на богатых средах. Так, на разбав­ленном в 10 раз мясо-пептонном агаре вырастает в 5-10 раз больше колоний, чем на исходном, на агаризованной воде — еще боль­ше, но их уже нужно подсчитывать через месяц, а не через три дня, как на МПА и рассматривать в бинокулярную лупу, так как колонии очень малы. Трудность изучения состоит в том, что они растут очень медленно и экспериментатор должен затратить дли­тельное время. Необходимо также иметь в виду, что в отдельных микрозонах и в естественной почве могут создаваться высокие концентрации растворенных и нерастворенных органических питательных веществ. Примером микрозон первого типа может служить ризоплана с непрерывным поступлением большого ко­личества корневых выделений, а примером микрозон второго типа— отмерший корешок растения или погибший дождевой червь.