Количественное определение. При количественном определении кумаринов учитывается то или иное специфическое свойство кумарина
При количественном определении кумаринов учитывается то или иное специфическое свойство кумарина. Способность лактонного кольца кумарина к обратимому размыканию и замыканию в зависимости от рН среды используется в гравиметрическом методе определения суммы кумаринов в растительном сырье. Специфическое отношение кумаринов к щелочи лежит в основе метода нейтрализации (обратное титрование), которое применяется как для определения суммы кумаринов, так и для индивидуальных компонентов. Способность кумаринов давать устойчивые красно-оранжевые и красно-пурпурные растворы с диазотированным сульфаниламидом в щелочной среде используется в колориметрических методах количественного определения суммы кумаринов и индивидуальных компонентов. Флуоресценция при УФ возбуждении в видимой области лежит в основе флуориметрических методов количественного определения кумаринов. \
Для количественного определения кумарина примеряются спек- трофотометрические методы, где учитывается изменение оптической плотности растворов кумаринов при длине волны максимум, поглощения в УФ области спектра того или иного кумарина в зависимости от его концентрации на основе удельных показателе: поглощения. Колориметрическим, флуориметрическим и спектров фотометрическим методам чаще всего предшествует хроматограф» чесКое разделение кумаринов на бумаге и в тонком слое сорбент) поэтому эти методы называются хромато-оптическими методами
Количественное определение кумаринов проводят также поляр графическим методом.
Многообразие методов количественного определения в сыр позволяет провести правильный выбор метода для анализа расти тельного сырья, учитывая структуру природных кумаринов.
Методика количественного определения кумаринов в плод( амми большой Fructys Ammi maidis (ФС 42-540-72). Зрелые плоды? амми большой (Ammi majus L.) семейства сельдерейных (зонтич-| ных) Apiaceae (Umbelliferae) используются в качестве лекарствен*! ного сырья для получения препарата «Аммифурин», который пред4 ставляет собой сумму фурокумаринов — изопимпинеллина и бер4 гаптена. Количественное определение этих соединений проводя^ хроматоспектрофотометрическим методом.
Около 2 г (точная навеска) измельченного сырья, просеянного сквозь сито с размером отверстий 0,16 мм, извлекают 120 мл хлороформа в аппарате Сокслета в течение 2 ч (12—15 сливов). ХлорсН формное извлечение отфильтровывают и упаривают в вакууме до* суха. Сухой остаток растворяют при слабом нагревании в хлорсй форме и количественно переносят в калиброванный пикнометр вме| стимостью 5 мл. 0,02 мл полученного раствора наносят микропипет| кой на старт хроматограммы. Хроматограмму затем импрегнирую! 10 %-ным формамидом в метйловом спирте, подсушивают на воздухе в течение 4 мин и ведут хроматографирование восходящи^ способом в системе м-гептан — бензол (4:1) при t = 19—20 °G в течение 5—6 ч на бумаге марки «С». Затем хроматограмму cyuiai в сушильном шкафу в течение 2 ч при температуре 40—50 -С и прЫ сматривают в УФ свете. Пятна бергаптена с Rf = 0,63 и изопим» пинелина с Rf — 0,53 обводят карандашом и вырезают. Вырезаннь^ участки бумаги помещают соответственно в колбочки со шлифо| вместимостью 10—15 мл, заливают 5 мл 95 %-ного спирта и оста! вляют стоять на 10—12 ч, затем нагревают на водяной бане пр| f ~ 40 °С в течение 10 мин. Элюат отфильтровывают и спектрофоте) метрируют в кювете с толщиной слоя 1 см на фоне элюата чистог| кусочка той же хроматограммы. Оптическую плотность раствора измеряют при следующих длинах волн: йзопимпинеллина — 313 нм бергаптена — 311 нм. Процентное содержание изопимпинеллии и бергаптена х вычисляют по формуле
х ^,0,1,045-100 ~V2mE\Ku (100-и.) '
где Vj — объем извлечения, мл; Va — объем извлечения, нанесенного на хроматограмму, мл; Vs — объем элюата, мл; т — масса навески сырья, г; £J% — удельный показатель поглощения: изо- пимпинеллина-518, бергаптена-651; £>а — оптическая плотность элюата; w — потеря в массе сырья при высушивании, %.
Содержание изопимпинеллина в сырье должно быть не менее 0,3 %, бергаптена — не менее 0,15 % в пересчете на абсолютно сухое сырье.
Реактивы и оборудование- хлороформ; метиловый спирт (метанол); формамид; я-гептан; бензол; этиловый спирт (этанол).
Бумага хроматографическая марки «С»; бюксы с притертыми крышками; пикнометры вместимостью 5 мл; микропипетки измерительные вместимостью 0,2 мл; колбы с нормальным шлифом вместимостью 10—15 мл; воронки стеклянные для фильтрования диаметром.5 см; весы лабораторные аналитические; набор сит; аппарат Сокслета; камеры хроматографические для ТСХ; шкаф сушильный лабораторный; УФ лампа; бани водяные лабораторные; спектрофотометры СФ-4А, СФ-16.
Методики количественного определения кумаринов в корнях горичника Radix Peucedani (ФС 42-538-72). Корни горичника Мо- рисона (Peucedanum morisonii Bess.) и горичника русского (Р. ruthenicum At. В.) семейства сельдерейных (зонтичных) Apiaceae (Umbelliferae) используются в качестве лекарственного сырья для получения препарата «Пеуцеданин».
Количественное определение пеуцеданина в корнях горичника проводят методом нейтрализации.
Около 15 г (с погрешностью не более 0,01 г) измельченного сырья (сито с размером отверстий 1 мм) помещают в колбу вместимостью 250 мл, заливают 150 мл 95 %-ного этилового спирта и оставляют при периодическом встряхивании на сутки. 100 мл спиртового извлечения, соответствующее навеске сырья 10 г, отфильтровывают и отгоняют досуха в присутствии 1 г CaCOs.
Остаток в колбе извлекают порциями этилового эфира по 25 мл 4—5 раз при* слабом нагревании с обратным холодильником. Эфирные извлечения сливают в делительную-воронку вместимостью 250 мл и обрабатывают 5 %-ным КОН 3 раза по 5 мин порциями по 25 мл. Объединенные эфирные извлечения промывают один раз 25 мл воды, сушат безводным сульфатом натрия, отфильтровывают и отгоняют досуха. Остаток растворяют в 20 мл 95 %-ного этилового спирта (на холоду, при интенсивной перемешивании),добавляют 20 мл 0,1 н. раствора NaOH и смесь оставляют при комнатной температуре на 20 мин. К щелочному раствору добавляют 5—6 капель 0,1 %-ного спиртового раствора тимолового синего, 10 мл хлороформа. Смесь взбалтывают, дают отделиться хлороформному слою (2—3 мин) и избыток щелочи оттитровывают 0,1 н. H2S04 (до желтого окрашивания). 1 мл 0,1 н. NaOH соответствует 0,0258 г пеуцеданина.
Процентное содержание пеуцеданина х вычисляют по формуле
КО,0258 • 100 • 100* т (100 — w)
где V — количество 0,1 н. NaOH, пошедшего на титрование, мл; т — масса навески сырья, соответствующая объему спиртового извлечения, взятого для анализа, г; w — потеря в массе сырья при высушивании, %.
Содержание пеуцеданина в абсолютно сухом сырье должно быть не менее 1,5 %.
Реактивы и оборудование: этиловый спирт (этанол); СаС03; этиловый эфир; КОН; Na2S04 (безводн.); NaOH, 0,1 н.; тимолового синего, 0,1%- ный раствор в * этиловом спирте; хлороформ; H2S04.
Набор сит; колбы с нормальным шлифом вместимостью 15, 20, 250 мл; аппарат вибрационный; воронки стеклянные для фильтрования диаметром 5 см; колбы конические вместимостью 250 мл; холодильники (обратные) стеклянные лабораторные с нормальным шлифом; бани водяные лабораторные; воронки делительные вместимостью 250 мл; бюретки вместимостью 25 мл; капельницы стеклянные; цилиндры мерные на 250 мл.
Методика количественного определения кумаринов в плодах пастернака Fructus Pastinacae sativae (MPTУ 42 №3043-71). Плоды пастернака посевного (Pastinaca sativa L) семейства сельдерейных (зонтичных) [Apiaceae (Umbelliferae)] используются в качестве сырья для получения препаратов «Бероксан» (смесь бергаптена и ксантотоксина) и «Пастинацин» (смесь ксантотоксина, изопимпи- неллина, бергаптена).
«Бергаптен» и «Пастинацин» стандартизуются по ксантотоксину.
Количественное определение ксантотоксина проводится полярографическим методом.
Около 2 г (точная навеска) измельченных плодов (сито с размером отверстий 0,5 мм) извлекают 100 мл 95 %-ного этилового спирта при нагревании на кипящей водяной бане в колбе с обратным холодильником в течение 2 ч. Спиртовое извлечение помещают в колбу для отгонки. Операцию извлечения повторяют еще с 50 мл 95 %-ного этилового спирта при нагревании в течение 10 мин.
Из объединенных спиртовых извлечений отгоняют спирт, а остаток переносят количественно в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят объем раствора 95 %-ным этиловым спиртом до метки.
0,2—0,4 мл (точный объем) полученного извлечения доводят до 5 мл 95 %-ным этиловым спиртом, добавляют 3 мл 5 %-ного тетраэтиламмонийиодида в 50 %-ном этиловом спирте, пропускают водород 5—10 мин и полярографируют при катодной поляризации в интервале 1,00—1,6 В (относительно внутреннего анода).
Параллельно полярографируют стандартный спиртовой раствор, содержащий 0,0001 г ксантотоксина в 1 мл раствора.
процентное содержание суммы фурокумаринов х в пересчете на ксантотоксин вычисляют по формуле
Анху^т Х~ HVxm '
где А — содержание ксантотоксина в стандартном растворе, г; Н — высота волны стандартного раствора, мм; Нх — высота волны исследуемого раствора, мм; V2 — объем извлечения, полученного из навески плодов, мл; V1 — объем извлечения, взятого для поля- рографирования, мл; т — навеска абсолютно сухого сырья, г.
Процентное содержание суммы фурокумаринов в пересчете на абсолютно сухое сырье должно быть не менее 1 %.
Реактивы и оборудование: этиловый спирт (этанол); тетраэтил- аммоний иодид; ксантотоксин (ст. р-р).
Бюксы с притертыми крышками; колбы с нормальным шлифом вместимостью 25, 50 мл; колбы мерные вместимостью 10 мл; холодильники обратные стеклянные лабораторные с нормальным шлифом; весы лабораторные аналитические; набор сит; бани водяные лабораторные; полярограф.
Методика количественного определения кумаринов в плодах псоралеи костянковой (Fructus Psoraleae) (МРТУ 42 № 3856-70). Плоды псоралеи костянковой семейства бобовых (Psoralea drupacea Beg.) [Fabaecae (Leguminosae)] используются в качестве лекарственного сырья для получения препарата «Псорален», представляющего собой смесь псоралена и ангелицина.
Количественное определение псоралена и ангелицина в плодах псоралеи костянковой проводится хроматоколориметрическим методом.
10 г (точная навеска) измельченных на кофейной мельнице и просеянных сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм плодов вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, заливают 25 мл 80 %-ного этилового спирта и взбалтывают 2 ч на вибрационном аппарате. Извлечение доводят тем же спиртом до метки, хорошо перемешивают и фильтруют через стеклянный фильтр № 1.
Полоску хроматографической бумаги марки «Б» размером 18 X 52 см предварительно импрегнируют 15 мл 10 %-ного фор- мамида в метиловом спирте. На стартовую линию, отстоящую на 10 см от верхнего края узкой стороны листа бумаги, отступая по 4,5 см с обеих боковых сторон бумаги, микропипеткой сплошной линией наносят 1 мл извлечения. Бумагу слегка подсушивают и помещают в камеру для хроматографирования. Система растворителей: гексан — бензол — метиловый спирт (5:4:1, по объему). Способ хроматографирования нисходящий. Хроматографирование ведут 2,5—3 ч, т. е. до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет линии, на 2—3 см отстоящей от нижнего края бумаги. Высушенную хроматограмму просматривают на химископе УЧ-1 и пятна фурокумаринов обводят карандашом. Первое от старта пятно соответствует псоралену (Rf 0,67), второе — изопсоралену (Rf ~ 0,71). Участки бумаги с пятнами фурокумаринов режут на мелкие кусочки, вносят в две колбы с притертой пробкой и приливают по 40 мл 95 %-ного этилового спирта. Элюирование проводят при комнатной температуре на вибрационном аппарате в течение 2 ч. Элюат фильтруют через стеклянный фильтр № 1. В колбу вместимостью 25 мл к 5 мл элюата приливают 3 мл 0,05 н. NaOH и 2 мл диазореактива (ГФ X, с. 370). Одновременно в другой колбе смешивают 10 мл 95 %-ного этилового спирта, б мл 0,05 н. NaOH и 4 мл диазореактива — готовят раствор для контрольных кювет. Содержимое колб перемешивают спустя 1 ч, переливают в кюветы с толщиной слоя 0,5 см и определяют оптическую плотность окрашенных растворов по шкале правого барабана фотоколориметра ФЭК-М. Псорален определяют с зеленым (область максимального пропускания 500—530 нм), изопсорален с синим светофильтром (область максимального пропускания 480—500 нм), измерение повторяют и вычисляют среднюю величину оптической плотности (D).
Стандартные растворы готовят из стандартных образцов псора- лена и изопсоралена в концентрации 0,0025—0,0030 мг/мл на 95 %- ном этиловом спирте. Одновременно с колориметрированием элюа- тов берут по 5 мл раствора стандартного образца каждого фуроку- марина и способом, описанным выше, определяют их оптическую плотность.
Процентное содержание отдельных фурокумаринов х в сырье вычисляют по формуле
50-40Р1Л100 *=10. 1,002(100-ш) '
где 50 — общий объем извлечения, мл; 40 — объем спирта, использованного для элюирования отдельных фурокумаринов с бумаги, мл; Dj — оптическая плотность элюата; D2 — оптическая плотность раствора стандартного образца; А — концентрация стандартного раствора, мг/мл; 1,0 — количество извлечения, нанесенного на хроматографическую бумагу, мл; w — потеря в массе сырья при высушивании, %.
Сумма псоралена и изопсоралена в пересчете на абсолютно сухую массу должна быть не менее 0,9 %.