Іммобілізація клітин мікроорганізмів
Зміст
· Вступ
· Іммобілізація клітин мікроорганізмів
· Способи іммобілізації клітин мікроорганізмів
· Застосування іммобілізованих мікроорганізмів
· Список використаної літератури
Вступ
У 70-х роках XX століття з'явилися перші публікації про іммобілізацію клітин мікроорганізмів, а перше промислове застосування іммобілізованих клітин було здійснено в Японії в 1974 р. З їхньою допомогою одержували аспарагінову кислоту.
Іммобілізовані клітини мають ряд переваг як перед іммобілізованими ферментами, так і перед вільними клітинами:
– відсутність витрат на виділення й очищення ферментів;
– зниження витрат на виділення й очищення продуктів реакції;
– більш висока активність і стабільність;
– можливість створення безперервних і напівбезперервних автоматизованих процесів;
– здатність до тривалого функціонування поліферментних систем без екзогенних кофакторів.
Для іммобілізації можуть бути використані клітини в різному стані: живі й ушкоджені в різному ступені. Одностадійні реакції можуть здійснювати й живі, і ушкоджені клітини. Поліферментні реакції проводять із застосуванням живих клітин, які можуть тривалий час регенерувати АТФ і коферменти (НАДФ, НАД).
Проблема використання ферментативної активності іммобілізованих мікроорганізмів має глибоке коріння. Більше 150 років тому швидкий спосіб одержання оцту був заснований на застосуванні мікроорганізмів, адсорбованих на деревній стружці. Методи іммобілізації клітин схожі з методами іммобілізації ферментів.
Хімічний метод заснований на утворенні ковалентних зв'язків з активованим носієм, на поперечній зшивці клітин за рахунок активних груп у клітинній оболонці з біфункціональними реагентами (наприклад, глутаровим альдегідом).
До фізичних методів відносяться адсорбція й агрегація.
Іммобілізація клітин шляхом включення в різні гелі, мембрани, волокна заснована на хімічних і фізичних взаємодіях. Хімічні методи використовуються рідше в порівнянні з іншими методами й малопридатні для іммобілізації живих клітин. Найбільшого поширення одержало включення клітин до складу гелів, мембран і волокон. При такому способі іммобілізації клітини можуть зберігати життєздатність й у присутності поживного середовища розмножуватися в приповерхневих шарах гелю. Біокаталітична активність цілих іммобілізованих клітин у цей час може бути використана в різних галузях науки й техніки:
– при біосинтезі й трансформації таких сполук, як амінокислоти, органічні кислоти, антибіотики, стероїди, вуглеводи, вуглеводні, нуклеотиди й нуклеозиди;
– у пивоварстві й виноробстві;
– при очищенні стічних і природних вод;
– при екстрагуванні металів зі стічних вод;
– при асиміляції сонячної енергії;
– при виготовленні водневих сонячних елементів;
– в азотфіксації;
– в аналітичних цілях при виготовленні електродів.
Найбільша кількість досліджень по іммобілізації клітин мікроорганізмів проведена японськими дослідниками. Особливі успіхи були досягнуті ними в області синтезу амінокислот, органічних кислот й антибіотиків. У Московському державному університеті був розроблений метод одержання аспарагінової кислоти, який за ефективністю не уступає японським. Клітини E.coli, включені в армований поліакриламідний гель, були з успіхом використані для одержання аспарагінової кислоти, період напівжиття каталізатора – 110 діб. Іммобілізувати можна не тільки клітини мікроорганізмів, але й клітини рослинних і тваринних тканин, використовуючи їх для синтезу фізіологічно активних сполук.
Цікаві можливості відкриваються й при іммобілізації клітинних органел як активних поліферментних систем. Все це свідчить про перспективність розвитку одного з напрямків біотехнології, пов'язаного з вивченням і застосуванням іммобілізованих клітин.
Методи іммобілізації універсальні для всіх типів біокаталізаторів - індивідуальних ферментів, клітин, субклітинних структур, комбінованих препаратів.
Поряд з іммобілізацією ферментів останнім часом все більшу увагу приділяють іммобілізації клітин, субклітинних структур. Це пояснюється тим, що у разі використання іммобілізованих клітин відпадає потреба у виділенні й очищенні продуктів мікробного синтезу; уможливлюється одержання поліферментних систем, що здійснюють багатостадійні ферментні процеси.
У промислових процесах все частіше використовують клітини у стані спокою. Справді багато високовартісних продуктів синтезуються зазвичай у стаціонарній фазі росту продуцентів. Клітини, що ростуть і розмножуються, порушують структуру носія, вивільняються з нього і забруднюють цільовий продукт. Для пригнічення росту іммобілізованих клітин рослин використовують дефіцит фітогормонів, а ріст клітин бактерій пригнічують додаванням антибіотиків.
Іммобілізовані клітини мікроорганізмів використовують для біотрансформації органічних сполук, поділу рацемічних сумішей, гідролізу ряду складних ефірів, інверсії сахарози, відновлення й гідроксилювання стероїдів. Іммобілізовані хроматофори використовують у лабораторних установках для синтезу АТФ, а пурпурові мембрани ? для створення штучних фотоелектричних перетворювачів - аналогів сонячних батарей. Створюється реактор на основі іммобілізованих клітин дріжджів для одержання етанолу з меляси, у якому дріжджі зберігали б здатність до спиртового бродіння впродовж 1800 год. Із більш як 2000 відомих нині ферментів іммобілізована й використовується в інженерній ензимології приблизно десята частина (переважно оксидоредуктази, гідролази й трансферази).
Для здійснення хімічних процесів за допомогою іммобілізованих ферментів застосовують колонні, трубчасті, пластинчасті й танкерні реактори різного обєму й продуктивності. Іммобілізовані ферментні системи функціонують у реакторі у вигляді нерухомої фази, через яку проходить середовище із субстратом, що підлягають хімічному перетворенню (гетерогенний каталіз). У таких реакторах поряд з безперервним режимом використовується й періодичний.
Іммобілізація клітин мікроорганізмів
Крім іммобілізованих ферментів застосовують іммобілізовані клітини мікроорганізмів. Переваги роботи з іммобілізованими клітинами порівняно з ферментами в тому, що мікробна клітина містить усі необхідні кофактори і ферменти, необхідні для їх регенерації; не потрібнастадія виділення йочищення ферментів;можна отримати велику концентрацію клітин, що сприяє продукції вторинних метаболітів. Крім того, внутрішньоклітинні ферменти найстабільніші у своєму звичайномуоточенні. Живі іммобілізовані клітини зручні для безперервною культивування, оскільки швидкість перебігу можна регулювати незалежно від росту клітин, що працюють як мультиферментні реакційні системи, залежні від АТФ і коензимів.
Іммобілізовані тим чи іншим способом клітини мікроорганізми часто використовують для проведення трансформації або біосинтезу ряду сполук протягом кількох місяців і навіть років. Слід зауважити, що іммобілізація клітин проходить у природних біотопах. У ґрунті, в мулі, в гірських породах, на поверхні рослин мікроорганізми головно перебувають у закріпленому стані. У 1732 р. Г. Бургаве в Німеччині використав закріплені на буковій стружці бактерії для виробництва оцту. Нині цей спосіб відомий як «метод Шуценбаха».
Іммобілізовані мікроорганізми здійснюють як одностадійні, так і багатостадійні процеси. У 1970 p. К. Мосбах зі співавт. (Швеція) опублікував результати вивчення можливості проведення такого складного, НАД-залежного процесу, як гідроксилювання стероїдів за допомогою іммобілізованого в поліакриламід ний гель міцелію гриба Curvularia lunаta.
Японською фірмою «Танабе Сейяко» здійснено в 1974 р. промисловий синтез аспарагінової кислоти з використанням іммобілізованих клітин Е.coliі показано переваги цього методу над синтезом аспарагінової кислоти за допомогою іммобілізованої аспартази або вільних клітин.
Труднощі при використанні іммобілізованих клітин обумовлені утворенням деяких побічних продуктів, а також виникненням додаткового дифузійного барєру для субстрату і продукту, яким є клітинна стінка та цитоплазматична мембрана.
Для іммобілізації використовують мікроорганізми різних таксономічних груп. Це можуть бути живі чи мертві різною мірою пошкоджені (заморожені, висушені оброблені органічними розчинниками та ін.) клітини. Іммобілізованими можуть бути не тільки вегетативні клітини, але й спори. Вибір стану клітин і способу іммобілізації залежить від того, який процес необхідно здійснити - одностадійний чи багатостадійний. Одностадійні процеси у багатьох випадках можуть здійснювати пошкоджені клітини. Часто при цьому виникає необхідність збільшити проникність клітинної стінки і цитоплазматичної мембрани. Саме це обумовлює необхідність дії на такі мікроорганізми токсичних органічних розчинників (толуолу, ацетону) або біфункціональних реагентів (наприклад, глутарового альдегіду). Поліферментні процеси трансформації та біосинтезу більш ефективно здійснюють живі клітини, здатні регенерувати кофактори. Пошкоджені клітини й екзогенні кофактори використовують для цього лише в деяких випадках.
Вибір методу іммобілізації залежить від реакції або процесів, які будуть здійснювати клітини. Загалом для іммобілізації клітин мікроорганізмів використовують ті ж способи, що і для іммобілізації ферментів - адсорбцію, ковалентне і поперечне зв'язування, включення в гелі. Ковалентне і поперечне зв'язування використовують частіше для мертвих або пошкоджених клітин. Клітини мікроорганізмів іммобілізують флокулюванням, приєднанням до поверхні носія, включенням у полімерний матрикс, використовують вільні суспендовані клітини в реакторі з напівпроникною мембраною або у вигляді крапель у двофазній рідкій системі.
Носіями при іммобілізації мікроорганізмів можуть бути природні та синтетичні сполуки, що здатні забезпечувати необхідні процеси і параметри. Серед різних матриць для іммобілізації клітин мікроорганізмів найуживанішими є полімери - похідні акрилової кислоти.
Як адсорбенти використовують різноманітні матеріали - природні та синтетичні, наприклад кераміку, вугілля, пісок, подрібнені черепашки, металеву стружку, капрон, поліуретан.
Використання великопористих носіїв-адсорбентів (пористого скла, кераміки) дало змогу створити установку для переробки органічних відходів з метою одержання метану (США). Ефективним є використання адсорбованих клітин у процесах очищення стічних промислових вод.
Для іммобілізації окремих видів мікроорганізмів використовують спосіб іммобілізації, заснований на утворенні ковалентних зв'язків молекул білків та інших сполук клітинної оболонки мікроорганізму з носіями, активованими біфункціональними реагентами.
Спосіб включення клітин у полімери різноманітної природи є найуживанішим як у лабораторному, так і у промисловому масштабі. Використовують при цьому природні (карагінан, агар, желатин, хітозан, колаген, різноманітні пектини) і синтетичні (поліакриламідний гель, фото чутливі полімери, поліуретани, полівініловий спирт та ін.) полімери. Залежно від їх механічних властивостей і характеру проведеного процесу, полімери використовують у формі гранул, мембран, волокон. Спосіб включення клітин у поліакриламідний гель використовують завдяки таким властивостям, як простота приготування, відносна дешевизна, можливість включення клітин будь-якого розміру і заданої кількості, пружність фіксації клітин, пружність гранул на стирання і розрив (властивість, необхідна для реакторів з перемішуванням). Для промислового виробництва пива, наприклад, аспарагінової кислоти, використовують клітини Е. coli,включені в поліакриламідний гель. Вихід становить 95% від теоретичного.
Використання карагінану замість поліакриламідного гелю і клітин Brevibacterium flavum замість B. ammoniagenes дало змогу у пять разів знизити вартість одержаної яблучної кислоти. Цей метод із 1980 р. використовують у промисловому масштабі (Японія).
За допомогою живих клітин іммобілізованих у карагінані проводять процеси одержання сорбози, ізолейцину і етанолу. Мікроорганізми ростуть у такому гелі з тією ж швидкістю, що і вільні клітини, а іноді з більшою. Ріст зосереджений у приповерхневому шарі гелю, тому дифузійні ефекти незначні, кисень і компоненти живильного середовища добре використовуються.
Включення в альгінатні гелі належить до м'яких методів іммобілізації - клітини залишаються живими і можуть здійснювати поліферментні процеси. Перевагою Са-альгінатногогелю є його хороші дифузні якості. В цей гель можуть бути включені лише мікроорганізми і ферменти з дуже великою молекулярною масою. Кисень, глюкоза, альбумін дифундують у гель з тією ж швидкістю, що і у водному середовищі.
У багатьох випадках, (при синтезі агроклавіну, пеніциліну, гідроксилюванні прогестерону) включення клітин в альгінат дає кращі результати порівняно не тільки з поліакрилмідним гелем, але й із карагінаном та іншими гелями (табл. 4).
Саме Са-альгінатний гель поряд із фоточутливими полімерами використовують у промисловому масштабі для синтезу етанолу. Тривала життєздатність дріжджів у альгінаті забезпечується доброю аерацією в реакторі баштового типу. Альгінатні гранули, що містять дріжджі та виготовлені в асептичних умовах знизьким pН (4.0),забезпечують відсутність сторонніх мікроорганізмів протягом чотирьох місяців.
Клітини мікроорганізмів іммобілізовані в альгінаті, використовують для виробництва моноклональних антитіл (фірма LKB, Швеція). Клітини в гелі залишаються життєздатними 180 діб і синтезують зацей час до 20 кг моноклональних антитіл.
Клітини мікроорганізмів, іммобілізовані вказаним способом, використовують для реакцій трансформації, які проводять, у двофазних системах (вода - органічний розчинник). Такі умови використовують для трансформації малорозчинних у воді сполук, наприклад стероїдів і ефірів ментолу.
До параметрів, що характеризують іммобілізовані системи, належать стабільність біокаталізатора, яка вимірюється періодом півжиття (коливається від кількох днів до кількох років) і продуктивність реактора (неживі клітини переважно мають продуктивність від 500 до 2000 молів продукту на 1 л об'єму реактора за період двох півжиттів).
Іммобілізовані клітини використовують при проведенні безперервних та напівбезперервних процесів, що полегшує автоматизацію, дає змогу використовувати реактори різного типу, наприклад, безперервні реактори з витісненням (колонки з подаванням розчину згори без перемішування), реактори з перемішуванням і продуванням повітря (періодичні та безперервні), пластинчасті реактори та ін.
Способи іммобілізації
В даний час розроблено велику кількість методів іммобілізації, багато з яких повторюють прийоми іммобілізації ферментів. Методи іммобілізації можна розділити на групи відповідно до використовуваному фізичного процесу: прикріплення, впровадження, активація та агрегація.
Необхідно розрізняти методи іммобілізації, в результаті яких клітини стають нерухомими при природному зростанні на наданій підходящої поверхні, і ті, при яких вирощена клітинна популяція «активно» обробляється для досягнення іммобілізації. «Активні» методи більш широко поширені і можуть бути використані для клітин в будь-якому фізіологічному стані. «Природні» методики, загалом, більш доступні і дешеві, так як не вимагають ніяких додаткових витрат. Розглянемо найбільш поширені методи, розділені на чотири групи.
Прикріплення.
Рис. Іммобілізація клітин методом прикріплення
До цієї групи належать усі форми іммобілізації, при якій клітини яким-небудь способом прикріплюються до поверхні або твердого носія (рис. 3.1). Прикріплення може бути наслідком природної адгезії або індукуватися хімічно. Природна адгезія клітин - широко поширене явище, послужила об'єктом багатьох досліджень, однак його механізм ще не до кінця ясний. Це найпростіший метод іммобілізації, який використовується в двох найстаріших промислових процесах, заснованих на використанні іммобілізованих клітин: виробництві оцту і очищення стічних вод.
В системах, розроблених нещодавно, перевага віддається використанню дрібнодисперсних твердих носіїв, матеріалів типу піску, який, наприклад, у процесах з псевдозрідженим шаром забезпечує набагато більшу площу поверхні для прикріплення на одиницю об'єму реактора, ніж у традиційних процесах. Частинки носія, які зазвичай мають діаметр менше 1 мм, просто завантажуються в реактор, який потім инокулируется (або засівається) звичайним чином.
Клітини природним чином прикріплюються до поверхні і по мірі росту утворюють активну плівку. Товщина плівки може складати один шар клітин, як у випадку іммобілізації клітин тканин тварин, або кілька міліметрів, як у випадку мікроорганізмів, що застосовуються для очищення стічних вод. Клітини, які не здатні до природного прикріплення до поверхні, можуть бути прикріплені за допомогою хімічних засобів, таких як зшивання за допомогою глутарового альдегіду, або прикріплення до кремнийсодержащим носіям з допомогою силанизации, або хелатообразование з оксидами металів. У цих випадках міцність прикріплення така ж, як і при природному адгезії.
Прикріплені клітини безпосередньо контактують з навколишнім середовищем і тому схильні до дії сил тертя, що виникають при русі частинок і рідини відносно один одного. Досить імовірно, що при цьому клітини відділяються і переходять у рідку фазу, тому даний спосіб не застосовують, якщо необхідно залишити рідина безклітинній. У такій системі дуже важко керувати товщиною біоплівки і навіть визначати її, що також є недоліком.
При іммобілізації клітин шляхом прикріплення особливу увагу слід приділяти правильному підбору носія, придатного для промислового використання, і заселення його потрібним мікроорганізмом або популяцією мікроорганізмів з можливо більшою щільністю.
Включення.
Рис. Іммобілізація клітин методом включення
Сутність методів цієї групи полягає в іммобілізації шляхом включення клітин в заздалегідь підготовлену або утворену оболонку. Такою оболонкою може служити просто межа розділу фаз між двома не змішуваними рідинами. У цьому випадку клітинна суспензія эмульгируется в органічному розчиннику і потім ресуспендируется у вигляді крапель у водній фазі. Прикладом заздалегідь приготовленої оболонки є напівпроникна мембрана, яка використовується для мікро-та ультрафільтрації. При цьому поживні речовини легко дифундують до клітин, що знаходяться за мембраною.
Основне застосування даної системи визначається можливістю з її допомогою очистити робоче середовище від клітин, що використовується головним чином при роботі з клітинними культурами тканин ссавців.
Агрегація.
Клітини можна іммобілізувати шляхом флокуляції з утворенням великих агрегатів, що дозволяє зберегти їх безперервно працюючому реакторі, наприклад, з нерухомим або псевдозрідженим шаром. Природна флокуляція дріжджових клітин відбувається після закінчення ферментації, іммобілізовані таким шляхом клітини, що використовуються у баштових ферментери при виробництві пива. Міцелій грибів також утворює агрегати у вигляді сферичних пелет. Флокуляція є найхарактернішим процесом очищення стічних вод активним мулом. Для посилення агрегації можуть використовуватися штучні флокулянти.