Тема № 3. Дослідження реплікації ДНК та транскрипції РНК. Аналіз механізмів мутацій, репарацій ДНК. Засвоєння принципів отримання рекомбінантних ДНК, трансгенних білків.
Мета заняття:Знати закономірності матричного синтезу нуклеїнових кислот, етапи цих процесів, механізми мутацій, репарацій та виникнення і розвитку спадкових захворювань. Засвоїти механізм дії антибіотиків та інших інгібіторів синтезу нуклеїнових кислот. Вміти кількісно визначити вміст ДНК у біологічному матеріалі.
Актуальність теми: В процесі біосинтезу нуклеїнових кислот можливі різноманітні порушення нуклеотидної послідовності під впливом фізичних (нагрівання, іонізуючі, корпускулярні опромінення), хімічних (мутагени) та біологічних (віруси) факторів. У медичній практиці широко використовуються фармацевтичні препарати, що інгібують біосинтез нуклеїнових кислот у прокаріотичних організмах та гальмують поділ клітин пухлин у онкологічних хворих.
Конкретні завдання:
Ø Оволодіти методом кількісного визначення ДНК в біологічному матеріалі з метою оцінки інтенсивності реплікаційних та біосинтетичних процесів.
Ø Трактувати молекулярно–біологічні закономірності збереження та передачі генетичної інформації, роль ферментних систем, що забезпечують напівконсервативний механізм реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів.
Ø Пояснювати механізми функціонування ферментної системи транскрипції РНК.
Ø Трактувати механізми регуляції експресії генів на рівні транскрипції оперонів, які включають структурні та регуляторні гени, промотор та оператор.
Ø Трактувати біохімічні механізми генетичних рекомбінацій, ампліфікації генів, особливості регуляції експресії генів у еукаріотів.
Ø Аналізувати наслідки геномних, хромосомних та генних мутацій, механізми дії найбільш поширених мутагенів, біологічне значення та механізми репарації ДНК (репарація УФ–індукованих генних мутацій).
Теоретичні питання
1. Біологічне значення реплікації ДНК. Сутність відкриття Дж. Уотсона та Фр. Кріка (1953). Напівконсервативний механізм реплікації; схема експерименту М.Мезелсона та Ф.Сталя.
2. Загальна схема біосинтезу ДНК. Ферменти реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів. Молекулярні механізми реплікації ДНК: топологічні проблеми (топоізомерази, хелікази); значення антипаралельності ланцюгів ДНК; фрагменти Оказакі. Етапи синтезу дочірніх ланцюгів молекул ДНК.
3. Загальна схема транскрипції; кодуючі та некодуючі ланцюги ДНК. РНК–полімерази прокаріотів та еукаріотів. Етапи та ферменти синтезу РНК. Сигнали транскрипції: промоторні, ініціаторні, термінаторні ділянки генома.
4. Процесинг – посттранскрипційна модифікація РНК. Антибіотики – інгібітори транскрипції.
5. Регуляція експресії генів прокаріотів: схема регуляції за Ф. Жакобом та Ж. Моно. Будова Lac–оперону E.сoli: структурні та контрольні гени; промотор, оператор; регуляторний ген та утворення білкових репресорів. Принципи функціонування Lac–оперону: репресія, індукція.
6. Особливості будови та експресії геному еукаріотів. Молекулярна організація ДНК еукаріотів (екзони, інтрони; послідовності, що повторюються). Ядерний хроматин та хромосоми еукаріотів; каріотип людини.
7. Генетичні рекомбінації; транспозони. Рекомбінації геному прокаріотів (трансформація, трансдукція, кон’югація). Процеси рекомбінації у еукаріотів на прикладі утворення генів H– та L–ланцюгів молекул імуноглобулінів.
8. Ампліфікація генів (гени металотіонеїну, дигідрофолатредуктази).
9. Регуляція експресії генів еукаріотів на рівні транскрипції; cистема транскрипційних сигналів – промоторні послідовності, енхансери, атенюатори, сайленсери. Ковалентна модифікація гістонів та НГБ як один з механізмів контролю експресії генів.
10. Фази клітинного циклу еукаріотів. Біохімічні механізми контролю вступу клітини до мітозу; сdс2–кіназа, циклін.
11. Мутації: геномні, хромосомні, генні (точкові); роль у виникненні ензимопатії та спадкових хвороб людини.
12. Біохімічні механізми дії хімічних мутагенів – аналогів азотистих основ, дезамінуючих, алкілуючих агентів, ультрафіолетового та іонізуючого випромінювання.
13. Біологічне значення та механізми репарації ДНК. Репарація УФ-індукованих генних мутацій; пігментна ксеродерма.
Практична робота