Тема № 4. Дослідження білків плазми крові: білки гострої фази запалення, власні та індикаторні ферменти. Дослідження небілкових азотовмісних і безазотистих компонентів крові.
Мета заняття: Знати основні білки плазми крові та вміти використовувати їх кількісні показники для діагностики гіпер- і гіпопротеїнемій, диспротеїнемій, парапротеїнемій, спадкових захворювань, пов’заних з недостатнім синтезом тих чи інших білків крові. Знати небілкові азотовмісні сполуки крові, що складають залишковий азот та засвоїти методи визначення залишкового азоту і середніх молекул крові та вміти застосовувати отримані показники в діагностиці захворювань.
Актуальність теми:У плазмі крові виявлено і описано понад 100 білків, які відрізняються між собою за фізико-хімічними та функціональними властивостями. Серед них є транспортні білки, ферменти, інгібітори ферментів, гормони, фактори коагуляції, антитіла, антикоагулянти, антиоксиданти та інші.
Білки плазми визначають її властивості: колоїдно-осмотичний тиск і, тим самим, постійний об’єм крові, в’язкість крові, підтримання постійного рН крові та функції, а саме: захисну, регуляторну, терморегуляторну, дихальну, трофічну тощо.
Залишковий азот є важливим показником стану білкового обміну. Значення небілкового азоту і його окремих компонентів проводиться з метою діагностики порушень функції нирок, печінки, ендогенної інтоксикації при ряді захворювань та оцінки ступеня ниркової недостатності.
Конкретні завдання:
Ø Провести розділення білків на фракції методом висолювання.
Ø Знати діагностичне значення зростання в крові вмісту білків „гострої фази” запальних процесів.
Ø Розуміти молекулярно-біохімічні механізми змін вмісту в плазмі крові секреторних та тканинних ферментів.
Ø Охарактеризувати основні азотовмісні небілкові сполуки, їх метаболічне походження.
Ø Вміти визначити залишковий азот крові.
Ø Оволодіти спектрофотометричним методом визначення середніх молекул.
Ø Дати оцінку отриманим результатам і використати їх у клініко - діагностичних цілях.
Теоретичні питання
1. Основні групи білків плазми крові, їх склад та вміст в нормі і при патології. Фактори, що впливають на вміст білків у плазмі крові: гіпер- та гіпо-протеїнемії.
2. Альбуміни і глобуліни. Суть методу електрофорезу білків плазми крові. Електрофореграми при різних захворюваннях.
3. Роль глутатіону в захисті від пероксидного окисненні ліпідів, вітаміни антиоксиданти.
4. Глікопротеїни, їх будова, біологічна роль, зміна складу при захворюваннях.
5. Білки гострої фази запалення: С-реактивний білок, церулоплазмін, гаптоглобін, кріоглобулін, α1-антитрипсин, α2-макроглобулін, інтерферон, фібронектин. Їх діагностичне значення.
6. Ферменти плазми крові: власні (секреторні), екскреторні та індикаторні (тканинні) ферменти. Калікреїн-кінінова та ренін-ангіотензинова системи, їх біологічна роль.
7. Діагностичне значення дослідженя активності ферментів та ізоферментів плазми крові: креатинфосфокінази, ЛДГ, АсТ, АлТ, амілази, ліпази, холінестерази.
8. Поняття про загальний і залишковий азот крові. Небілкові азотвмісні компоненти крові. Діагностичне значення їх визначення.
9. Безазотисті органічні та неорганічні сполуки крові, їх метаболічне походження. Молекули середньої маси (середні молекули), їх метаболічне походження. Клініко-діагностичне значення їх визначення.
10. Азотемія, її види та причини виникнення, диференціювання їх в клініці.
11. Кількісні зміни залишкового азоту крові при парентеральному харчуванні, переливанні крові, застосуванні плазми, сироватки чи плазмозамінників.
12. Біохімічні аспекти використання деяких лікарських препаратів при азотемії.
Практична робота
Дослід 1. Фракціонування білків плазми крові методом висолювання: визначення альбумінів і глобулінів плазми крові.
Принцип методу.Білки можна виділити з розчинів у вигляді осадів. Існує багато різних способів осадження білків.
Осадження білків концентрованими розчинами нейтральних солей (амонію сульфату, натрію хлориду тощо) називають висолюванням. Більшість реакцій висолювання, а також реакції зі спиртом, ацетоном є зворотними.
Якщо до розчинів білків додавати солі лужних і лужноземельних металів, то їх іони адсорбуються молекулами білків, знімають з них електричні заряди і перетворюють їх на електронейтральні. Надалі колоїдні частки укрупнюються, що зумовлює утворення осаду. Реакцію висолювання зумовлює дегідратація молекул білка з одночасною нейтралізацією електричних зарядів. Процес висолювання білків є оборотною реакцією, оскільки осад білка можна знову розчинити шляхом розведення його водою або зменшення концентрації солей діалізом. Для висолювання білків потрібна різна концентрація солей. Це дає змогу отримати різні білкові фракції.
Білки осаджують за різних концентрацій солей. Деякі з них вже випадають в осад за концентрації амонію сульфату приблизно до 1/10 від насичення, глобуліни – за напівнасичення, альбуміни – за повного насичення.
Матеріальне забезпечення:розчин сироватки крові, амонію сульфат, лійки, фільтри.
Хід роботи:У пробірку вливають 2 – 3 мл сироватки крові, додають рівний об’єм насиченого розчину амонію сульфату, перемішують. В осад випадають глобуліни (50 % насичення розчину), які мають відносно велику молекулярну масу і невеликий заряд. Осад відфільтровують. До осаду на фільтрі додають невелику кількість води, в отриманому розчині містяться глобуліни, наявність яких виявляють шляхом кип’ятіння, спостерігають утворення осаду. Фільтрат з розчином альбумінів розливають у дві пробірки.
У першу пробірку додають кристалічний амоній сульфат до повного насичення (100 % насичення розчину). В осад випадають альбуміни. Вміст другої пробірки кип’ятять, спостерігають утворення осаду альбумінів.
Фракціонування білків методом висолювання використовують у клінічній практиці для одержання нативних білків з біологічних рідин.
Фракційне розділення білків сироватки крові.
| Назва білка | Сіль, що використовується | Ступінь насичення | Утворення осаду |
| Глобуліни Альбуміни |
Пояснити отримані результати. Зробити висновок. Звернути увагу на використання фракційного осадження білків у медичній практиці.
Клініко-діагностичне значення.Осадження білків застосовується при виділенні їх з тканин, розділенні суміші білків, для виявлення у різних біологічних рідинах. Методом висолювання виділяють три фракції білків плазми крові: альбуміни, глобуліни, фібриноген.
Під час денатурації відбувається руйнування нативної просторової структури білкової молекули, що проявляється зменшенням або повною втратою їх розчинності, зміною хімічних властивостей білків, втратою специфічної біологічної активності. Явище денатурації широко використовують у практиці. Так, денатуровані білки краще піддаються дії протеолітичних ферментів.
Під час денатурації втрачається біологічна активність білків (відбувається інактивація ферментів, гормонів, вірусів), тому водний розчин фенолу (карболової кислоти) застосовують як антисептик.
У практичній діяльності використовують в’яжучі речовини (танін, танальбін, протаргол тощо), які денатурують поверхневий шар білків слизової травного тракту з утворенням плівки коагульованого білка. Остання покриває слизову і таким чином зменшує її механічне та хімічне подразнення.
Явище денатурації білків широко використовують у промисловості (при випіканні хліба, дубінні шкіри тощо). Методом висолювання білків користуються для добування білків, що мають кристалічний вигляд, виділення препаратів ферментів і гормонів.
Реакції осадження білків мають важливе значення в практиці. Їх застосовують для вивчення властивостей білків, виділення білків із розчинів, виявлення наявності білків у сечі (при нефриті, серцевій декомпенсації тощо).