Определение количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ).
Отбор средней пробы. При анализе партии продукта готовят среднюю пробу. Для разных пищевых продуктов установлены нормы отбираемых средних проб и правила их отбора. Однако во всех случаях необходимо соблюдать условия, исключающие контаминацию исследуемого продукта посторонними микроорганизмами.
При исследовании жидких и полужидких продуктов (молоко, сметана, соусы и др.) их тщательно перемешивают и затем отбирают простерилизованным черпаком 50-100 см3 в стерильную посуду. Пробы плотных продуктов (мясо, колбаса, рыба, кулинарные изделия и др.) отбирают из толщи продукта в разных местах. Предварительно поверхность исследуемых участков прижигают раскаленным ножом и по ней делают глубокий разрез стерильным скальпелем. Края разреза раздвигают стерильным пинцетом и вырезают стерильными ножницами небольшие кусочки продукта. Отобранные таким образом из разных мест образцы измельчают, собирают в стерильную тару и составляют из них среднюю пробу.
При отборе средней пробы таких продуктов, как сливочное масло, творог, сыр используют стерильный щуп, который вводят в продукт с одного края и доводят до противоположного вглубь и наискосок. Затем стерильным скальпелем берут кусочки из нескольких мест отобранной пробы по длине щупа, измельчают их и помещают в стерильную посуду.
Подготовка пробы к анализу. При исследовании плотных продуктов из средней пробы берут навеску 1-10 г, переносят ее в стерильную ступку и тщательно растирают. Если продукт очень плотный, то его растирают с предварительно прогретым кварцевым песком. Растертый продукт вносят в колбу с 99 или 90 см3 стерильного физиологического раствора (0,85 %-й раствор хлорида натрия). Содержимоеколбы осторожно взбалтывают в течение 5мин. В колбе получается первое разведение продукта (1:10),из которого готовят последующие разведения.
Навеску сливочного масла расплавляют на водяной бане при температуре не выше 45º С. после чего вносят стерильной пипеткой 1 см3 продукта в 9 см3 физиологического раствора, получая разведение1:10.
Для исследования жидких и полужидких продуктов из их средней пробы после тщательного перемешивания отбирают стерильной пипеткой 1 см3 и вносят его в пробирку с 9 см3 стерильного физиологического раствора.
Приготовление разведений. Пищевые продукты могут содержать значительное количество микроорганизмов, поэтому, чтобы получить изолированные колонии, необходимо приготовить десятикратные разведения продукта. Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду или физиологический раствор разливаютпо 9 см3 в стерильные сухие пробирки с пробками.
Полученное первое разведение продукта тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в нее и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз, затем той же пипеткой отбирают 1 см3 суспензии и переносят её во вторую пробирку с 9 см3 стерильного физиологического раствора. Получают второе разведение (1:100). Пипетку нельзя погружать в жидкость во избежание смывания микроорганизмов с ее наружной поверхности. Новой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое второго разведения, набирают 1 см3 и переносят в следующую пробирку с 9 см3стерильной воды, получая третье разведение (1:1000). Таким же образом готовят последующие разведения до получения необходимого. Для приготовления каждого разведения следует использовать отдельную стерильную пипетку.
Посев в чашки Петри. Для определения КМАФАнМ используют метод глубинного посева на плотные питательные среды. Схема посева приведена на рис.3.
Стерильной пипеткой отбирают из пробирки по 1 см3 соответствующего разведения суспензии и переносят его в 2-3 пустые стерильные чашки Петри. Через 15 мин после внесения разведения суспензии чашки заливают питательной средой. Для этого над пламенем спиртовки вынимают пробку из пробирки или колбы с расплавленной и остуженной до 45-50 °С питательной средой и обжигают края. Затем приоткрывают крышку чашки так, чтобы только вошло горлышко колбы и осторожно вливают 10-15 см3 ПС, толщина слоя должна быть около 5 мм. Крышку чашки закрывают и сразу же легкими вращательными движениями чашки перемешивают питательную среду с посевным материалом, после чего оставляют на 10-15 мин в горизонтальном положении для застывания среды. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат с температурой 37±1 °С на 24-48 ч.
Подсчет выросших колоний. После инкубации отбирают чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний и подсчитывают их визуально или с помощью специального прибора для подсчета колоний. При подсчете колоний чашки просматривают в проходящем свете и отмечают подсчитанные колонии чернилами или тушью. Количество микроорганизмов в 1 см3 (или в 1 г) продукта (КМАФАнМ) определяют как произведение количества выросших колоний (N) на показатель разведения (n):
КМАФАнМ= N • 10n КОЕ/см3
Анаэробные микроорганизмы не определяются чашечным методом, так как для их выращивания необходимо создать анаэробные условия. Культивирование анаэробов осуществляют в анаэростатах.