ПОСЕВ И ИНКУБАЦИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА, ОЦЕНКА И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Достоверная клиническая интерпретация результатов микробиологического обследования достигается при обязательном соблюдении следующего правила: культуральное исследование любого диагностического материала обязательно включает параллельное микроскопическое исследование осадка той же пробы диагностического материала, полученного после обработки детергентами с последующим отмыванием либо нейтрализацией и центрифугированием. Все мазки из осадка готовят после выполнения процедуры посева.
Процедура посева
Рабочее место микробиолога необходимо организовать таким образом, чтобы исключить операторские ошибки.
Перед процедурой посева необходимо подготовить пробирки с питательными средами, промаркировать их согласно нумерации анализов в рабочем журнале и последовательно расположить в вертикальном штативе. Аналогичным образом подготовить и промаркировать предметные стекла для приготовления мазков.
В нижней части флакона со скошенной питательной средой нередко наблюдается образование конденсата. До посева биологического материала этот конденсат желательно удалить. Не следует производить посев на среды, только что вынутые из холодильника. Нужно вынимать их из холодильника заранее, чтобы среда к моменту посева согрелась до комнатной температуры.
Перед началом забора посевного материала пипеткой необходимо убедиться в том, что номер пробирки с посевным материалом соответствует номерам пробирок с питательной средой и номеру предметного стекла для приготовления мазка, проверить соответствие расположения пробирок с готовым осадком и предметных стекол в порядке их регистрационных номеров.
Посев диагностического материала производят следующим образом:
– стерильной пипеткой набирают 1,0–1,2 мл полученного после обработки и нейтрализации осадка, оставив приблизительно 0,2 мл для последующего приготовления мазка для микроскопии;
– соблюдая стерильность, вносят равные объемы пробы диагностического материала (примерно по 0,5–0,6 мл) на верхнюю треть скошенной питательной среды в 2 пробирки с разными плотными питательными средами;
– засеянные пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками и помещают их в наклонном положении в штатив таким образом, чтобы материал равномерно распределился по всей поверхности питательной среды;
– остаток осадка забирают той же пипеткой. 1–2 капли осадка наносят на подготовленное и пронумерованное предметное стекло для получения мазка размером 1х2 см. Мазки из осадка жидких материалов (моча, промывные воды и др.) во избежание смывания материала при окраске желательно готовить на стеклах, предварительно обработанных яичным белком;
– по завершении посева всех проб засеянные пробирки помещают в термостат при температуре 37°С; наклон штатива должен обеспечивать горизонтальное расположение поверхности питательной среды и исключать смачивание пробки засеянным материалом.
– подготовленные мазки оставляют сушиться на воздухе, затем окрашивают по методу Ziehl-Neelsen.
Инкубация посевов
Микобактерии размножаются чрезвычайно медленно – время деления клетки составляет 18–24 часа. С этим связана необходимость длительной инкубации для получения видимого роста колоний. При первичном посеве микроскопически отрицательного материала средняя продолжительность появления видимого роста микобактерий туберкулеза на плотных питательных средах может составить 20–46 дней. Рост отдельных штаммов появляется через 60 и даже 90 дней. Это обусловливает необходимость выдерживать посевы в термостате до 10 недель для выдачи отрицательного результата при отсутствии роста микобактерий. Длительный срок инкубации диктует необходимость соблюдения ряда правил для сохранения жизнеспособности клеток и ростовых свойств питательной среды.
Микобактерии туберкулеза требовательны к составу питательных сред, составу газовой среды и чувствительны к различным токсическим агентам, которые могут поступать в пробирку из некачественной среды, вместе с воздухом, в результате некачественной деконтаминации.
Оптимальная температура инкубации микобактерий туберкулеза составляет 35–37°С. При снижении температуры скорость размножения микобактерий туберкулеза быстро снижается. Исключение составляют образцы, полученные из кожи или поверхностных повреждений, которые могут содержать M. marium, M. ulcerans или М.haemophilum. Эти микобактерии лучше всего размножаются при температуре 25–33°C. M. avium или M. xenopi для оптимального роста нуждаются в температуре 40–42°C.
После посева флаконы желательно инкубировать так, чтобы поверхность скошенной среды оставалась горизонтальной – по крайней мере, в течение первых 2–3 суток после посева. Затем ватно-марлевые пробки заменяют герметичными резиновыми или силиконовыми, после чего засеянные пробирки переводят в вертикальное положение. Посевы, выполненные в течение одного дня, следует помещать в отдельные ящики или штативы с указанием даты посева и размещать их в термостате в порядке номеров регистрации в хронологическом порядке, не нарушая его при еженедельных просмотрах. Желательно не располагать посевы на полках термостатов или термальных комнат вблизи от двери, поскольку колебание температуры вследствие частого открывания двери может вызвать образование конденсата.
В отличие от агаровых, при использовании яичных сред инкубирование микобактерий не требует присутствия в воздухе 10% СО2, однако наличие повышенной концентрации углекислого газа стимулирует более ранний и более интенсивный рост микобактерий.