Результаты и их интерпретация
Культуры, которые образовывают пигмент и на свету и в темноте – скотохромогенные.
Культуры, которые не образовывают пигмент в темноте, но становятся желтыми или оранжевыми после световой экспозиции – фотохромогенные.
Культуры, которые не образовывают пигмент на свету и в темноте, относятся к нефотохромогенным.
Только один вид M szulgai может быть фотохромогенным при 25°C и скотохромогенным при 37°C.
Основные тесты для идентификации M. tuberculosis
В лабораторной практике используются культуральные и биохимические методы исследования микобактерий. Для правильной оценки выделенных микобактерий необходимо использовать комплекс методов.
Биохимические методы идентификации микобактерий
Ниациновый тест
Ниациновый тест является основным тестом, используемым для идентификации M.tuberculosis.
Принцип метода. Ниацин (производное никотиновой кислоты) играет чрезвычайно важную роль в осуществлении всех окислительно-восстановительных реакций, происходящих в клетках кислотоустойчивых микобактерий. Ниацин продуцируют все микобактерии, однако исследования показали, что у M. tuberculosis в результате блокирования ряда метаболических путей никотиновая кислота накапливается в больших количествах, во много раз превышающих ее содержание в клетках микобактерий других видов. Штаммы M. tuberculosis, не продуцирующие ниацин, встречаются очень редко.
Ниациновый тест не должен использоваться как единственный для идентификации M. tuberculosis, так как отдельные штаммы M. bovis, в том числе и субштаммы BCG, а также некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (M. simiae, M. chelonae chemovar niacinogenes) обладают относительно высокой способностью синтезировать ниацин и давать положительную реакцию.
Ниациновая проба основана на том, что продуцируемая микобактериями никотиновая кислота, вступая в реакцию с цианистыми соединениями, дает ярко-желтое окрашивание.
Ниациновый тест дает наиболее убедительные результаты в тех случаях, когда для его постановки используют колонии, выросшие на яичной среде, поэтому и рекомендуется применять среду Левенштейна-Йенсена. Возраст культур должен быть не менее 3–4 недель, причем для постановки ниацинового теста необходимо использовать пробирки с ростом не менее 50 колоний. Так как растущие колонии M. tuberculosis выделяют ниацин в питательную среду, посевы со сливающимися колониями могут давать ложноотрицательные результаты, так как экстрагирующая жидкость в этом случае не может контактировать с питательной средой. При наличии сливающихся колоний для обеспечения контакта жидкости с питательной средой необходимо либо снять и удалить часть колоний, либо проколоть поверхность среды..
Реакция требует свободного доступа кислорода на протяжении всего исследования, поэтому следует пользоваться либо ватно-марлевыми пробками, либо специальными металлическими колпачками, обеспечивающими свободный доступ воздуха в пробирку.
Ниациновый тест можно выполнять либо с растворами химических реактивов, приготавливаемыми непосредственно перед постановкой пробы, либо с заранее приготовленными в лабораторных условиях или коммерческими бумажными полосками.
Ниациновый тест с растворами химических реактивов требует соблюдения максимальной осторожности, так как цианистые соединения чрезвычайно токсичны при ингаляции паров и вызывают слезотечение, а анилин обладает онкогенным воздействием и способен проникать через кожный барьер. Эти обстоятельства ограничивают применение ниациновой пробы с растворами химических реактивов.
В большинстве бактериологических лабораторий для постановки ниациновой пробы пользуются специально приготовленными бумажными полосками. Преимущество этого варианта метода заключается в использовании вместо цианистых соединений роданистого калия – вещества более безопасного и доступного, а также в быстроте реакции, позволяющей через 3–4 часа получить ответ о принадлежности выделенной на плотной питательной среде культуры к микобактериям человеческого вида или к другим микобактериям.
Следует иметь в виду, что из-за нестабильности растворов и реагентов необходимо строго соблюдать правила хранения и сроки использования как растворов и реагентов, так и бумажных полосок. В сомнительных случаях реагенты и полоски должны сравниваться со свежеприготовленными.