Тема: Дослідження мікрофлори води
Матеріали та обладнання: 1) мікроcкопи, 2) термостат, 3) електрична плитка, 4) спиртівки, 5) стерильні чашки Петрі, 6) стерильні пробірки, 7) стерильні піпетки на 1 мл, 8) пробірки з стерильнім поживним середовищем. 9) конічні колби па 300 мл, 10) сухий поживний агар, 11)карболовий еритрозин, 12) питна вода, 13) забруднена вода, 14) фільтр Зейтца, 15) мембранні фільтри № З, 16) канадський бальзам.
Основні відомості. У воді відкритих водойм є велика кількість різних мікроорганізмів: бактерії, актиноміцети, гриби, найпростіші, водорості тощо. Особливо багато різноманітних мікробів є в забруднених органічними рештками водах.
Мікрофлора води істотно відрізняється від мікрофлори повітря, її склад насамперед залежить від джерела, з якого взято воду для дослідження. Якщо вода забруднена, то в нійчастіше виявляються такі гнильні бактерії: Васіllus sиbtilis, Рroteus vulgaris, Рsеиdотопаs fluоrеscens та ін. Глибинні води і води артезіанських джерел містять мало мікробів. Водопровідна зода вважається доброю, якщо загальна кількість мікроорганізмів в 1 мл становить від 10 до 100, забрудненою — при 500 і більше.
Наявність у воді бактерій кишкової палички та її патогенних - серотипів свідчить про - фекальне забруднення, а також про можливість забруднення цієї води патогенними мікробами. З патогенних для людини бактерій і вірусів у воді можуть траплятися представники кишкової групи бактерій: шигели, сальмонели, холерні вібріони, патогенні, серотипи кишкової палички; збудники чуми, бруцельозу, туляремії; віруси: поліомієліту, епідемічного гепатиту тощо. Ступінь забруднення води мікробами групи кишкової палички оцінюють за колі-титром або колі-індексом.
Найменша кількість мілілітрів води, в якій виявляють хоча б одну клітину ЕзсНегісНіа соїі, називається колі-титром. Кіль-
кість клітин Езскегіскіа соїі виявлених у 1 л води, позначається колі-індексом
В нашій країні проводиться постійний санітарний нагляд і бактеріологічний контроль за якістю питної води та іншими джерелами водозабезпечення, що має дуже велике значення для профілактики багатьох інфекційних захворювань.
На практичних заняттях студентам можна рекомендувати провести дослідження мікрофлори питної води і води з найближчої річки прискореним методом прямого мікроскопування, запропонованим А. С. Разумовим у 1957 р. Суть цього методу полягає в тому, що за 30 хв можна встановити кількісний і якісний склад мікрофлори шляхом прямого мікроскопування препаратів на мембранних фільтрах, через які пропущено певний об'єм досліджуваної води. Одночасно з визначенням кількості бактерій вивчають і морфологічні ознаки їх.
Проведення роботи. В сухі чисті колби беруть проби води (50—100 мл). Підготовляють для роботи мембранні фільтри № 3 1, на їх краях тушшю надписують номер проби і вставляють у фільтр Зейтца. Останній з'єднують з насосом (можна брати насос Комовського) і пропускають через мембранний фільтр 10—30мл чистої (водопровідної) або 1 —10 мл води з річки чи озера. Після цього мембранний фільтр з осілими на його поверхні бактеріями підсушують у термостаті при температурі 37-45С його на 5 хв осадом доверху на клаптик фільтрувального паперу, змоченого у 3%-ному розчині карболового еритрозину2. Після закінчення фарбування фільтр знімають, кладуть у чашку на клаптик сухого фільтрувального паперу і промивають дистильованою водою для видалення фарби. Операцію повторюють (5—6 разів) до тих пір, поки краї фільтра не стануть слабко забарвленими. Промиті фільтри знову підсушують і протягом 1—5 хв дофарбовують розчином метиленової синьки. Залишок фарби-видаляють послідовним перекладанням фільтра на клаптики фільтрувального паперу, змочені дистильованою водою, щоб краї фільтра стали голубими. Відмитий фільтр обережно, щоб не деформувався, висушують і ставлять на краплю імерсійного масла на предметному склі осадом доверху. Зверху на нього наносять другу краплю масла, накривають накривним скельцем і мікроскопують. Для кращого освітлення бажано використовувати світлофільтри (білий, матовий, синій).
Кількість бактерій визначають за такою формулою:
X= n 
де х— кількість бактеріальних клітин в 1 мл води; S • 108 — фільтрувальна площа мембранного фільтра, мкм2;S1—; площа одного
1 Фільтри № 3 кип'ятять двічі по 20 хв у дистильованій воді для. видалення з них повітря і залишків розчинників.
2 До 100 мл 5%-ного розчину карболової кислоти додають 3 г сухого еритрозину, збовтують і фільтрують через паперовий фільтр.
облікового квадратика, мкм2; V— профільтрований об'єм води, мл\ п — середня кількість бактерій в 1 обліковому квадратику (середнє з 50 квадратиків).
Вимірювання площі квадратика лічильної сітки проводять, за допомогою об'єкт-мікрометра для кожної пари об'єктива і окуляра окремо.
Приклад. Для мікроскопа МБИ-1 з окуляром 15х і об'єктивом 90х 5 квадратиків лічильної сітки вкладаються в 7 поділок лінійки об'єктмікрометра. В цьому випадку розмір однієї сторони квадратика дорівнює 14 мкм, а площа — 196 мкм2.
На кожному квадратику, що обліковується, не повинно бути більш як 10—25 і менш як 1—2 бактеріальних клітин, інакше треба буде в першому випадку профільтровувати менший, а в другому — більший об'єм води.
У навчальних лабораторіях можна також досліджувати мікрофлору води при вирощуванні її на поживних середовищах. Для цього беруть у чисті сухі пробірки проби води (водопровідної 5— 10 мл, забрудненої — 1 мл). Водопровідну воду можна не розбавляти, а забруднену треба обов'язково розбавляти стерильною водою у таких співвідношеннях: 1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000 (чим більша забрудненість, тим більше розбавлення). З узятих проб води за допомогою стерильних піпеток беруть по 1 мл і вносять у пробірки з 10 мл стерильного розплавленого поживного середовища. Суміш швидко перемішують (обертанням пробірки між долонями), обпалюють краї пробірки на полум'ї спиртівки і обережно виливають засіяне середовище в стерильну чашку Петрі (див. рис. 22). Чашки позначають і ставлять у термостат на 2—3 дні до наступного заняття. Колонії, що виросли на поживному середовищі, підраховують звичайним способом або (коли їх багато) за допомогою приладу Вольфлюгеля. Зручно1 також використовувати дляцієї мети і спеціальний апарат для підрахунку колоній мікроорганізмів (рис. 32).
Якщо посів проводився без розведення, то кількість колоній, яку одержано на площі чашки Петрі, дорівнюватиме вмісту бактерій в 1 мл води. Кількість колоній в чашках з розведенням треба помножити на відповідне розведення, і тоді одержимо кількість мікробів, яка міститься в 1 мл досліджуваної води.
Лабораторна робота №5
Тема: Кількісний облік мікрофлори грунту бактеріоскопічним методом С. М. Виноградського (в модифікації О. Г. Шульгіної)
Матеріали та обладнання: 1) мікроскопи, 2) апарат для збовтування рідин, 3) предметні і накривні стекла, 4) конічні колби на 250—300 мл, 5) стерильні градуйовані мікропіпетки, 6) 96%-ний спирт, 7) карболовий еритрозин, 8) стерильна вода, 9) 0,1%-ний розчин агару, 10) міліметровий папір, 11) кедрова олія, 12) об'ект-мікрометр, 13) досліджуваний грунт, 14) фарфорові ступки, 15) туш.
Основні відомості. Грунт — основне джерело, звідки мікроби надходять у зовнішнє середовище — повітря й воду.
Рис.33. Апарат для збовтування суспензій.
Як зазначалося вище, мікрофлора ґрунту дуже численна і різноманітна. До її складу входять амоніфікуючі, нітрифікуючі, денітрифікуючі, азотфіксатори, сірко- і залізобактерії, целюлозорозкладаючі, пігментні бактерії, гриби, актиноміцети, водорості, найпростіші тощо. У верхніх шарах грунту можуть також бути збудники кишкових інфекцій: дизентерії, черевного тифу, колі-ептериту, холери, епідемічного гепатиту та і.н.
Кількісний і якісний склад мікрофлори грунтів залежить від
їх хімічного складу, фізичних властивостей, вмісту вологи й повітря, кліматичних умов, порироку, методів обробки, характеру рослинного покриву та багатьох інших факторів. Оскільки мікрофлора грунту дуже різноманітна (тут живуть аероби, анаероби, автотрофи, гетеротрофи, психро-філи, термофіли тощо), неможливо запропонувати якийсь універсальний метод її дослідження, тому користуються різними методами.
Один із засновників ґрунтової мікробіології — видатний російський мікробіолог С. М. Виноградський — розробив бактеріоскопічний метод визначення кількості бактерій в грунті. Цей метод і тепер широко застосовують у мікробіологічній, практиці. Суть його полягає в тому, що кількість бактерій у грунті визначають прямим підрахунком під мікроскопом. Для цього виготовляють мікроскопічні препарати з ґрунтової суспензії (з урахуванням ваги і об'єму), забарвлюють еритрозином і вивчають. Виявлену за допомогою мікроскопа кількість мікробів перераховують на 1 г грунту.
Проведення роботи. З середньої проби грунту беруть 5 г, вносять його в конічну колбу на 250—300 мл, додають туди 50 мл стерильної води 1 і збовтують протягом 5 хв на спеціальних апаратах (рис. 33). Після збовтування колби залишають на 5 сек, щоб осіли грубі частинки. Потім за допомогою стерильної градуйованої мікропіпетки беруть 0,01 мл суспензії і наносять її на знежирене предметне скло. До суспензії на склі додають краплю 0,01%-ного розчину агару (агар перед цим добре промивається і виготовляється на дистильованій воді). Суспензію перемішують з агаром і стерильним накривним скельцем розподіляють по предметному склу.
1 Д. Г. Зв'ягинцев (1966) встановив, що коли наважку грунту попередньо зволожити (0,4—0,8 мл води або 0,1%-ного розчину №2Р207 на 1 г грунту) і розтерти в стерильній ступці протягом 5 хв, щоб грунт мав вигляд пасти, то при цьому виявляється на препаратах значно більше мікробних клітин.
за допомогою трафарету1 на площі 4 см2. Після цього-препарат підсушують, фіксують 96%-ним спиртом і забарвлюють карболовим еритрозином (занурюють скло в розчин карболового еритрозину і витримують протягом 30 хв, а при потребі — і більше). Залишок фарби змивають, занурюючи препарат у воду (тильною стороною). Після промивання препарат знову підсушують і вивчають під мікроскопом з імерсійним об'єктивом.
Підрахувати кількість мікробів можна за такою формулою:
де q — середня кількість мікробів в 1 полі зору; SМ — площа мазка, см2; Sп.з—площа поля зору, мкм2; 108 — перерахунок на мкм2; С — розведення; V — об'єм суспензії, взятої для дослідження.
Приклад. Щоб дістати точні результати, роблять підрахунок кількості мікробів в 100 полях зору мікроскопа і визначають середню кількість їх на 1 поле зору. Далі визначають площу поля зору за формулою S = πr2. Щоб одержати радіус, вимірюють діаметр поля зору за допомогою об'єкт-мікрометра. Після цього визначають, скільки полів зору розміститься на площі препарату (4 см2). Для цього треба поділити площу препарату на площу поля зору. Одержану середню кількість мікробів на одне поле зору множать на кількість полів, які позмішуються на площі препарату. В результаті дістають кількість мікробних тілець в 0,01 мл суспензії. Щоб визначити кількість мікроорганізмів в 1 мл суспензії, знайдене число множать на 100. Щоб визначити кількість мікробів в 1 г абсолютно сухого грунту,.треба знайдене число помножити на ступінь розбавлення і поділити на наважку абсолютно сухого грунту, що міститься в 1 г сирого грунту.