Лизис клеток (или разрушение физическим, механическим способом);
2) ферментативное разрушение белков протеиназами и/или депротеинизацию клеточного лизата с помощью фенола и хлороформа; 3)центрифугирование для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл.
Затем ДНК осаждают из раствора этанолом и после центрифугирования растворяют осадок в буферном растворе. Вместе с ДНК частично выделяется и РНК, от которой избавляются с помощью фермента РНКазы.
Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия и хаотропный агент гуанидинизотиоцианат. Ряд современных методов предусматривает сорбцию ДНК на гранулах силикагеля в присутствии хаотропных веществ, центрифугирование и последующую элюцию ДНК с гранул в раствор. Некоторые фирмы продают наборы реактивов для выделения ДНК с использованием магнитных частиц, покрытых силикой SiO2. Некоторые коммерческие наборы предусматривают сорбцию ДНК на мембранах или ионообменных сорбентах. Фенолхлороформный метод экстракции ДНК считается стандартным.
Количественная и качественная оценка образца полученной ДНК осуществляется при последующей стандартной процедуре электрофореза ДНК в агарозном геле (тема 3) путм визуального сравнения с образцами известной концентрации. Спектрофотометрическое определение дат более точную характеристику препарату ДНК (тема 2).
. Выделение ДНК из бактерий Выделение общей или тотальной ДНК из клеток бактерий с использованием додецилсульфата натрия, протеиназ и фенола (Dhaese et al., 1979) является достаточно распространнным подходом. Метод простой и наджный, существует в ряде модификаций, как и многие другие методы.
Наряду с хромосомной ДНК выделяется также плазмидная и фаговая ДНК при их наличии в клетке, а также РНК, от которой несложно избавиться.
Плазматическая мембрана бактериальной клетки в этом методе разрушается под действием детергента додецилсульфата натрия (SDS, sodium dodecyl sulfate) – одного из самых распространнных поверхностно-активных веществ, или ПАВ. Целостность пептидогликанового слоя, так называемого муреинового мешка, при этом тоже нарушается. Путм обработки бактериального лизата фенолом, который денатурирует протеины, но не действует на нуклеиновые кислоты, удаляют все белки, в том числе белки нуклеоида. Другие органические соединения клетки и низкомолекулярные вещества теряются при высаживании ДНК этанолом, поскольку остаются в растворе. Полученный в результате центрифугирования образца осадок нуклеиновых кислот, дезоксирибонуклеиновой и рибонуклеиновой, растворяют в специальном буфере для хранения ДНК – буфере TE. Входящий в его состав хелатирующий агент – этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) предотвращает воздействие на ДНК клеточных нуклеаз, поскольку связывает необходимые для их работы катионы Mg 2+.
Для работы необходим штамм энтеробактерии кишечной палочки Escherichia coli XL1–Blue (StratageneTM) или штамм почвенной бактерии азоспириллы Azospirillum brasilеnse Sp245. Характеристики используемых в практикуме бактериальных штаммов и плазмид приведены в приложениях.
1. Произвести отдельной колонией посев бактерий штамма E.coli XL1–Blue (или A.brasilense Sp245) в пробирку
2. Перенести микропипеткой 1,5 мл культуры в микроцентрифужную пластиковую пробирку типа Eppendorf объмом 1,7 мл. Осадить клеткицентрифугированием в течение 5 мин при 10000 об/мин.
3. Удалить супернатантДобавить к осадку 300 мкл буфера ТЕ и с помощью микропипетки перевести клетки в суспензию вновь (ресуспензировать).
4. Добавить к суспензии клеток 100 мкл 5%-ного раствора SDS и перемешать переворачиванием пробирки 3 раза.
5. Добавить 150 мкл р-ра проназы (5мг/мл) и перемешать.