Инкубировать 1 (0,5) ч в термостате при температуре 37 С. Происходит лизис клеток и ферментативный гидролиз белков.
7. Высадить нуклеиновые кислоты из лизата спиртом. Для этого добавить в пробирку равный объм изопропанола (550 мкл) и центрифугировать втечение 10 минут. (После добавления спирта при необходимости можно прерваться; не центрифугировать пробу сразу, а убрать е в холодильник.
«Под спиртом» ДНК может храниться долгое время).
8. После центрифугирования отобрать микропипеткой остатки жидкости из пробирки. Растворить осадок нуклеиновых кислот в 500 мкл буфера ТЕ ипровести депротеинизацию образца, т.е. очистку ДНК от белков (пп. 9–12).
9. Добавить к раствору равный объм (500 мкл) смеси фенол–хлороформ и хорошо встряхнуть до образования стойкой эмульсии.
10.Разделить водную и органическую фазы путм центрифугирования в течение 5 мин. Фенол остается внизу, водная фаза с растворнной ДНК –вверху. Денатурированные фенолом белки диссоциируют с ДНК, теряют растворимость и собираются при центрифугировании на границе раздела фаз – в интерфазе. Т.е. идт экстракция ДНК из ДНП-комплекса.
11.Перенести микропипеткой водную фазу, содержащую ДНК, в чистую 1,7 мл пробирку. При отборе важно не засасывать наконечник интерфазу –плотный слой белсого цвета между водной и органической фазами в которой находятся агрегаты денатурированных молекул белков.
12.Провести ещ одну экстракцию ДНК хлороформом и избавиться от примеси фенола. Для этого добавить в пробирку с образцом равный объм смесихлороформ–изоамиловый спирт, перемешать и центрифугировать в течение 3 мин. Водную фазу перенести в чистую пробирку.
13.Оценить микропипеткой-дозатором или по меткам на пробирке получившийся объм водной фазы и добавить 1/25 объма 5М NaCl до конечнойконцентрации соли 0,2M. Затем добавить 2,5 объма холодного (–20 С) этанола для осаждения ДНК, точнее е натриевой соли. Оставить на 1–2 ч в морозильнике при температуре –20 С. Можно оставлять ДНК под спиртом и дольше, до того времени как образец потребуется.
14.Осадить нуклеиновые кислоты центрифугированием в течение 10 мин при максимальной скорости микроцентрифуги. Слить супернатант и промытьосадок. Для этого добавить к осадку 1 мл холодного 70% этанола и снова центрифугировать в течение 3 мин.
15.Слить 70% этанол, перевернуть пробирки на фильтровальную бумагу.
После того как вся жидкость стечет, пробирку с осадком нуклеиновых кислот (ДНК и РНК г) немного подсушить на воздухе до исчезновения запаха спирта. Растворить осадок в 50 мкл буфера ТЕ. Для электрофореза ДНК (тема 3) достаточно 5–10 мкл образца.
Некоторый объм водной фазы при этом неизбежно теряется, до 1/5 объма. На практике лучше пожертвовать этим объмом сейчас, чем чистотой препарата впоследствии. Фенол – токсичное раздражающее вещество, необходимо исключить контакт с кожей и работать с микроколичествами, соблюдая меры предосторожности.
Допускается просто слить 70 % спирт, без центрифугирования.
Избавиться от РНК при необходимости можно с помощью фермента РНКазы). Примесь РНК в препарате ДНК не влияет на рестрикцию или ПЦР.
Пересушивать осадок нельзя, в полностью высушенном виде он практически нерастворим в воде. Обычно осадки сушат на открытом воздухе не более получаса, под потоком нагретого воздуха или в твердотельном микротермостате достаточно 5 мин.
Выделение ДНК из лейкоцитов крови Изоляция общей ДНК из животной клетки не представляет особой сложности, поскольку плазмалемма, ядерная и митохондриальная мембраны «растворяются» в присутствии анионного детергента додецилсульфата натрия (SDS), а сложной клеточной стенки у животных в сравнении к примеру с растениями нет (см. работу 2.2). Высвободить ДНК из ДНК-белкового комплекса можно с помощью протеиназ или хаотропных солей.
Для этой же цели можно провести как и в случае с бактериями фенольную экстракцию ДНК. Другие вещества при последующем осаждении ДНК спиртом останутся в растворе, и избавиться от них несложно.
ДНК можно выделить из любых тканей, клетки которых содержат ядра, но количественный выход из разных тканей может быть различным.
Довольно часто для выделения ДНК используют кровь. Лейкоциты крови, в отличие от зрелых эритроцитов, содержат ядра. Общей ДНК, выделенной из 100 мкл цельной крови достаточно для проведения нескольких рестрикций, ПЦР и секвенирования. Митохондриальная ДНК и РНК также присутствуют в получаемом препарате. В приведнной ниже методике для освобождения ДНК от белков используется фенол. Под словом «фенол» биологимолекулярщики часто подразумевают смесь водонасышенного фенола с хлороформом 1:1, а не кристаллическое вещество. В смеси с хлороформом фенол работает эффективнее, а изоамиловый спирт гасит пенообразование.
Методика К 100 мкл цельной крови добавить 2 объма дистиллированной воды до конечного объма 0,3 мл. Тщательно перемешать и оставить на 15 минут.
Пробу центрифугировать в течение 10 минут, 5000 об/мин. Супернатант (надосадок, надосадочную жидкость) слить.
Осадок клеток отмыть двойным объмом буфера SSC, добавив в пробирку 200 мкл 1-кратного SSC. Перемешивание аккуратное.
Центрифугирование как в п.2. Супернатант слить.
К осадку добавить 54 мкл 0,2М ацетата натрия и 6 мкл 10%-ного раствора SDS. Осадок клеток тщательно ресуспензировать, т.е. перевести в суспензию вновь с помощью микропипетки или вортекса. Инкубировать при 37 С в течение 0,5–1 ч для прохождения лизиса (разрушения) клеток.
Добавить 2 объма буфера ТЕ и провести фенольную депротеинизацию образца. Для этого внести в пробирку равный объм фенол–хлороформнойсмеси, хорошо встряхнуть и центрифугировать. Отобрать водную фазу (верхний слой) в чистую пробирку, не захватывая интерфазу.