КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

ПРИНЦИП МЕТОДА:

Белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет (биуретовая реакция). Реакция обусловлена образованием биуретового комплекса в результате соединения меди с пептидной группировкой белка.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) NaCl, 0,9 %; 2) биуретовый реактив: 0,15 г CuSO₄ · 5H₂O и 0,6 г NaKC₄H₄O₆ · 4H₂O (виннокислый натрий-калий, или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н₂О, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10%-ого раствора NaOH (свободного от Na₂CO₃), добавляют 0,1 г KI и раствор доводят водой до 100 мл. Хранят в полиэтиленовой склянке; 3) стандартный раствор альбумина (БСА – бычий сывороточный альбумин), 10 мг белка в 1 мл; 4) раствор сыворотки с разведением в 10 раз: взять 1 мл сыворотки крови довести дистиллированной водой или 0,9 % раствором NaCl до объема 10 мл. Полученная концентрация белка будет соответствовать 6,5-8,5 г/л; 5) пробирки, пипетки; 6) ФЭК.

ХОД РАБОТЫ:

1. Опытная проба: к 4 мл биуретового реактива добавляют, избегая образования пены, 1 мл приготовленного раствора сыворотки крови с 10-ти кратным разведением.

2. Контрольная проба: к 1 мл раствора хлорида натрия приливают 4 мл биуретового реактива.

Пробы делают в 2-х повторениях!

Через 45-50 мин опытную пробу колориметрируют на ФЭКе при длине волны 540 нм против контрольной пробы (либо против дистиллированной воды).

3. Расчет ведут по калибровочной кривой. Данные для построения калибровочного графика приведены в таблице 4.

Таблица 4

Данные для построения калибровочного графика

При построении калибровочной кривой серию стандартных растворов обрабатывают так же, как и опытные пробы. Пробы перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего колориметрируют на ФЭКе при 540 нм против дистиллированной воды.

Измерения оптической плотности стандартных растворов начинают с растворов наименьшей концентрации.

Пробы делают в 2-х повторениях!

По результатам измерений строится калибровочная кривая. Средние значения оптической плотности (А) 2-х повторений (соответствующие различным концентрациям) наносят на миллиметровую бумагу на оси ординат, на оси абсцисс откладывают значения концентрации стандартных растворов белка (С).

Полученную по графику концентрацию белка в исследуемой опытной пробе умножают на величину разведения (х10).

Значения концентрации общего белка в сыворотке крови практически здоровых людей составляет 65-85 г/л.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

Опишите физико-химическую характеристику пептидной связи. Почему пептидные связи являются основой строения белка?

Как определить количество вещества с использованием калибровочной кривой?

Какова концентрация общего белка в сыворотке крови здорового человека?

Тема 4

ГИДРОЛИЗ БЕЛКА. ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕПТИДНОЙ СВЯЗИ

Гидролиз – распад сложного вещества на более простые составные части, связанный с присоединением воды по месту разрыва связей. В зависимости от применяемого катализатора различают кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз. При гидролизе простого белка конечными продуктами являются только аминокислоты. В организме гидролиз белка постоянно происходит в процессе, как пищеварения, так и жизнедеятельности клеток под действием протеолитических ферментов.

При кислотном гидролизе белка разрушаются некоторые аминокислоты: триптофан подвергается полному разрушению, а серин, треонин, цистин, тирозин, фенилаланин – частичному. Однако процент разрушения этих аминокислот невелик. При щелочном гидролизе белка отмечается более сильное разрушение аминокислот. Гидролизаты белка применяются в качестве лечебных препаратов.

Лабораторная работа №9

• ⇐ Назад
• 1
• 2
• 345
• 6
• 7
• 8
• 9
• 10
• 11
• 12
• 13
• 14
• 15
• 16
• Далее ⇒