Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции и носительства ВИЧ.

Методические указания

по теме 2.13 «Возбудители вирусных инфекций»

Тема 2.13.4 «Семейство ретровирусов. ВИЧ».

Таксономия.

Царство «Vira», семейство Retroviridae, подсемейство Lentivirinae, род Lentivirus, вид HIV (human immunodeficiency virus) или ВИЧ; различают 2 типа вируса: ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

2. Ультраструктура ВИЧ.

Вирион сферической формы, диаметром 100-140 нм; имеет нуклеоид конической формы, представленный 2 молекулами+РНК (двуспиральная) и обратной транскриптазой, упакованных в капсид, состоящих из гликопротеидов и протеина р24. Имеет суперкапсид, который представлен липопротеиновым слоем, в котором содержатся грибовидные выросты.

Цитопатогенные эффекты ВИЧ.

ВИЧ репродуцируется только в культурах Т-лимфоцитов, накопление высокое – до 10⁷-10⁹ вирусных частиц в 1 мл.

Обладает тропизмом к СД4- Т-хелперам и Т-индукторам, а также может поражать незрелые и периферические Т-клетки, дентритные клетки, макрофаги, несущие небольшое число молекул СД4.

Мишенями для ВИЧ оказались также эозинофилы, мегакариоциты, нервные, эпителиальные, эндотелиальные клетки и сперматозоиды, содержащие молекулу СД4 или её варианты.

Основным механизмом цитопатогенного действия (ЦПД) ВИЧ является повреждение им мембран клеток в результате бурного размножения. За 1 секунду через мембрану почкуется более 25 тысяч вирусных частиц, что заканчивается некрозом клеток; при этом происходит слияние оболочек клеток и образовывание синтиция, что обусловливает прямой путь передачи ВИЧ от одной клетки к другой.

Пути передачи ВИЧ-инфекции.

Источники инфекции – больные люди и вирусоносители ВИЧ.

Реально инфекционными являются: сперма, кровь, секрет шейки матки, грудное молоко у ВИЧ – инфицированной матери, спинномозговая жидкость.

Ведущими путями ВИЧ-инфицированния являются:

· половой контакт с ВИЧ-инфицированным;

· парентеральный (через кровь);

· от ВИЧ-инфицированной матери ребенку (вертикальный);

· пересадка донорских органов и тканей.

ВИЧ не передается: через воздух, воду, пищу, бытовые предметы, укусы кровососущих насекомых, рукопожатие, общение на работе или в транспорте.

Таким образом, вирус СПИДа нельзя считывать контагиозным.

Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции и носительства ВИЧ.

Основным методом лабораторной диагностики является обнаружение вирусоспецифических антител в сыворотке крови.

Антитела к ВИЧ появляются, как правило, начиная от 3-х недель и до 3-х месяцев, а иногда их появление может затянуться на целых 6 месяцев после инфицирования вирусом. Обычно этот период называется «периодом окна» или «сероконверсионным окном». В этот период тест на антитела к ВИЧ дает отрицательный результат, хотя человек на самом деле инфицирован вирусом. Это обусловлено тем, что нет достаточного количества антител, которые могли бы определяться лабораторным методом. В таких случаях, когда нельзя исключить заражение за последнее время, следует рекомендовать повторное обследование.

Ни один тест не дает, 100%-ой гарантии выявления ВИЧ!

Методы диагностики:

1. Иммуноферментный анализ (ИФА) – (английская аббревиатура - ELLISA)

Используется тест-система «Рекомбинант-ВИЧ» - это десятикомпонентный комплекс, основным реагентом которого является концентрированный очищенный антиген вируса СПИД, сорбированный на поверхности лунок полистироловых пластин. Один набор рассчитан на 180 исследований. Результаты ИФА учитывают спектрофотометрически при длине волны 492 нм, а при его отсутствии – визуально. Исследуемая сыворотка расценивается как положительно реагирующая, если значение оптической плотности при её взаимодействии с вирусным антигеном превосходит не менее чем в три раза, аналогичный показатель в контроле отрицательной сыворотки.

При визуальном учете реакция считается положительной, если имеются отчетливые различия в интенсивности окрашивания при реакции исследуемой сыворотки по сравнению с контрольной отрицательной сывороткой.

При обнаружении положительно реагирующей сыворотки данный образец исследуют повторно. При повторном получении положительного результата с помощью ИФА проверяют новую порцию сыворотки того же человека.

Если и в этом случае результат будет положительный, сыворотку исследуют дополнительно методом иммунного блотинга или иммунофлюоресценции.

Если при повторном исследовании или при исследовании новой порции сыворотки от того же человека получен отрицательный результат, а также при отрицательном результате анализа сыворотки методом иммунного блотинга, сыворотка признается не содержащей антител к вирусу СПИД.

Существенным недостатком ИФА является значительное количество ложноположительных реакций с сыворотками крови больных с аутоиммунными процессами.

Частота ложноположительных реакций существенно возрастает при исследовании длительно хранившихся сывороток, а также сывороток, подвергающихся многократному замораживанию.

2. Иммуноблотинг– тестирование на наличие антител к отдельным вирусным антигенам – является специфическим и применяется для обследования лиц, серопозитивных при обследовании с помощью ИФА.

Методика идентификации вирусспецифических белков HIV определяет белки сердцевины и поверхностной оболочки вируса СПИД – р15-18, р24-25, р41-45, р53-55, р64.

Положительным результатом анализа исследуемого образца сыворотки следует считать выявление антител к вирусным белкам р41, р110.

Ложноположительные сыворотки в иммуноблотинге выявляются с частотой 1:4.

3.Опасность ложноположительный реакций заставляет использовать разнообразные методы к повышению достоверности полученных результатов. Для этого применяют различные модификации иммуноблотинга, реакции конкурентного иммуноферментного анализа, радиоиммунопреципитации,прямойи непрямой иммунофлюоресценции.

4.Кроме серологического метода диагностики ВИЧ-инфекции, который позволяет определить вирус косвенным методом, количество вируса в биологических средах может определяться с помощью электронной микроскопии, а также с помощью биохимического метода для определния обратной транскриптазы или биологического метода (заражение культуры чувствительных клеток).

5.Для косвенного подтверждения диагноза СПИД могут быть использованы общие иммунологические реакции:

- определение общего количества лимфоцитов и числа Т-хелперов (оба показателя снижены);

- соотношение Т- хелперы: Т- супрессоры (у здоровых лиц 1,8-2,2; у больных СПИД – меньше 1,0);

- уменьшение числа естественных киллеров;

- уменьшение выработки эндогенного интерферона.

Следует учитывать повышение уровня сывороточных иммуноглобулинов в сыворотке крови.

При внутрикожном введении различных бактериальных или грибковых антигенов отмечаетсяснижение интенсивности аллергических реакций инередкоотсутствие отрицательных результатов тестов с туберкулином, бластомицином, гистоплазмином, кондидином, трихофитином, кокцидиоидином.

 

Меры предосторожности