Методы морфометрической оценки фиксированных тромбоцитов.
Еще в 1948 году Т.В. Кенигсон разработала в качестве лабораторного метода характеристики популяции тромбоцитов так называемую тромбоцитарную формулу, основанную на морфометрическом анализе фиксированных тромбоцитов, окрашенных по Романовскому
Согласно данному методу, фиксированные и окрашенные тромбоциты принято разделять на “юные”, “зрелые”, “старые” и дегенеративные формы, исходя из морфологических различий. В “юных” тромбоцитах большую часть цитоплазмы занимает гиаломер, грануломер развит слабо и представлен очень мелкими гранулами, плохо различимыми в световом микроскопе. В “зрелых” клетках гиаломер и грануломер выявляются одинаково четко, тогда как в “старых” тромбоцитах грануломер занимает практически весь объем клетки. Дегенеративные тромбоциты описывают как клетки произвольной формы, в которых наблюдается нарушение структуры как гиаломера, так и грануломера. Кроме того, при различных патологиях выделяют т.н. вакуолизированные тромбоциты – крупные оксифильные клетки, содержащие 2 и более вакуолей. Считается, что подавляющее большинство тромбоцитов здоровых людей составляют “зрелые” формы (80-85%) и только 15-20% приходится на “юные” и “старые” тромбоциты, а также формы раздражения (отросчатые тромбоциты) и дегенеративные клетки, независимо от возраста человека. Исходя из предложенной тромбоцитарной формулы следует, что все “зрелые” тромбоциты являются биологически полноценными клетками, а “юные” и “старые” – биологически неполноценными. Однако многократно показано, что функциональная активность тромбоцитов сильно варьирует в крови здоровых людей со сходной концентрацией тромбоцитов, т.е. суммарная активность пула тромбоцитов далеко не всегда зависит от содержания “зрелых” форм. Поэтому для характеристики качества тромбоцитов требуются более четкие морфометрические критерии.21 К настоящему моменту существуют разные подходы к морфометрии фиксированных тромбоцитов, однако исследователи не достигли единого мнения о том, какие морфометрические параметры тромбоцитов следует считать приоритетными.
Методы агрегометрии.
На сегодняшний день функциональную активность тромбоцитов чаще всего оценивают с помощью различных типов агрегометров. Агрегометр - аппарат, определяющий интенсивность агрегации тромбоцитов в нефиксированной плазме или цельной крови. Принцип действия агрегометра заключается в следующем: под действием активирующих факторов (коллаген, АДФ, ристоцетин и др.) в плазме происходит индуцированная агрегация тромбоцитов, в результате чего физические свойства плазмы изменяются. Эти изменения фиксируются прибором и затем выдаются в аналоговой или цифровой форме. На основе этих данных оценивают агрегационную активность пула тромбоцитов. Для лечебно-диагностических целей чаще всего используют оптические агрегометры и импедансные агрегометры.
Оптические агрегометры фиксируют изменения оптической плотности плазмы в ходе агрегации; импедансные агрегометры измеряют изменение сопротивления (импеданса) и других электрических параметров при прохождении микротоков в специальном электродном блоке, погруженном в различные образцы – в цельную кровь, плазму обогащенную тромбоцитами, разведенную кровь или во взвесь отмытых тромбоцитов. В импедансном агрегометре первоначальный контакт электродов с образцом приводит к образованию на них монослоя тромбоцитов. Затем при добавлении активирующих агентов (коллаген, АДФ и др.) происходит постепенная агрегация тромбоцитов на электродах, которая и приводит к характерным изменениям электрических свойств системы. Считается, что увеличение импеданса прямо пропорционально тромбоцитарной массе, осажденной на специальный электродный блок, т.о. кинетика импеданса позволяет количественно судит о кинетике процесса агрегации. Методом электронного импеданса можно проводить измерения агрегации даже там, где оптическая агрегация это сделать не может - в гемолизированных, иктеоичных и липемичных образцах.
Вместе с тем, способ оценки функциональной активности тромбоцитов с помощью агрегометрии имеет свои недостатки. Таким образом, методы агрегометрии дают лишь общую характеристику функциональной активности всей популяции тромбоцитов без оценки содержания функционально пригодных клеток и их структурной целостности.
5.Методы проточной цитометрии.
Основное преимущество проточных систем – их высокая скорость измерения характеристик клеток – связано с "аналоговым" принципом работы прибора, когда с высокой скоростью измеряются заданные оптические и кондуктометрические параметры клеток. Проточные автоматические гематологические анализаторы имеют встроенную жесткую высокостабильную систему анализа и приготовления клеточных суспензий, что обеспечивает высокую чувствительность измерений и воспроизводимость результатов анализа. Большой объем выборки (до 500 тыс. клеток) дает возможность существенно повысить точность измерений, что в любом случае улучшает надежность результатов и снижает статистическую погрешность.
Особенно большое значение это имеет для решения задач, связанных с классификацией клеток (в частности анализ лейкоформулы крови). Вместе с тем, возникает ряд методологических затруднений при оценке качества тромбоцитов методом проточной цитометрии. Данные, полученные на основании исследования морфологии неокрашенных тромбоцитов, не могут быть использованы для адекватной оценки качества тромбоцитов, поскольку, во-первых, популяция тромбоцитов обладает высокой гетерогенностью как по размерам, так и по внутренней структуре, во-вторых, до сих пор не сформулировано понятия “морфологической нормы” для тромбоцитов. Исходя из этого, цитометрические исследования тромбоцитов чаще всего проводят с использованием специальных флуоресцентных красителей.
Существует широкий набор флуоресцентных зондов для тромбоцитов, представленных в виде антител, связанных с флуорохромами, или в виде отдельных флуорохромов. Флуоресцентные зонды используются для выявления различных рецепторов и маркеров активации тромбоцитов; для выявления “юных” форм тромбоцитов, содержащих фрагменты ядер (тиазоловый оранжевый, бромистый этидий); для определения-содержания мертвых-клеток (пропидий--йодид,--аннексин-V) .
Однако отсутствие визуального контроля в проточной цитометрии может приводить к затруднениям в интерпретации результатов анализа, а также не позволяет определить содержание в популяции функционально пригодных и непригодных клеток. Следовательно, методы проточной цитометрии также не позволяют адекватно оценить морфофункциональный статус тромбоцитов.