Высаливание белков сыворотки крови сернокислым аммонием.
Реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда. Высаливание белков сернокислым аммонием может быть использовано для разделения белков друг от друга и получения их в кристаллическом виде. Например, глобулины сыворотки крови, имеющие большой молекулярный вес и меньший заряд легче высаливаются, чем альбумины. Глобулины осаждаются в полунасыщенном, а альбумины - в насыщенном растворе сернокислого аммония.
Высаливание белков – обратимый процесс. Осадок белка может вновь раствориться в воде после уменьшения концентрации солей. При этом белок не теряет своих естественных биологических свойств.
Ход работы.В пробирку поместить 2 мл сыворотки крови и добавить равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония, перемешать. Получается полунасыщенный раствор сернокислого аммония, в котором выпадает осадок глобулина.
Осадок отфильтровать через бумажный фильтр в пробирку. К фильтрату добавить сухой сернокислый аммоний до полного насыщения раствора. Выпавший осадок альбумина отфильтровать через бумажный фильтр. Проверить фильтрат на отсутствие белка с помощью биуретовой реакции.
Для доказательства обратимости высаливания, полученные осадки прямо на фильтрах смочить с 2-3 мл дистиллированной воды и отметить их растворение.
Сделать вывод.
7. Установить наличие белка ь моче при протеинурии.
Количественное определение белка в моче по методу
Брандберга-Робертса-Стольникова.
Клинико-диагностическое значение.В норме моча не содержит белка в количестве, обнаруживаемом обычными химическими методами. Белок в моче появляется при заболеваниях почек, при нарушении белкового состава крови.
Принцип метода. В основе метода лежит проба Геллера – денатурация белка азотной кислотой. Экспериментально установлено, что при наслаивании на азотную кислоту, растворы, содержащие 0,0033% белка, дают белое колечко в промежутке между второй и третьей минутами после наслаивания. Если колечко появляется непосредственно после наслаивания раствора белка на азотную кислоту, то путем последовательного разведения исследуемого материала достигают такого максимального разведения, при котором появляется кольцо между второй и третьей минутами. Умножая разведение на 0,0033%, получается процентное содержание белка в моче.
Ход работы.Приготовить 2 ряда пробирок (по 8 в каждом). Во все пробирки первого ряда прилить по 1 мл концентрированной азотной кислоты.
В пробирках второго ряда развести исследуемую мочу методом кратных разведений. Для этого в первую пробирку и вторую пробирки этого ряда налить по 1 мл исследуемой мочи, во вторую и все последующие - по 1 мл дистиллированной воды.
После перемешивания из второй пробирки перенести 1мл жидкости в третью, затем после перемешивания такой же объем из третей пробирки перенести в четвертую и т.д. до конца ряда. Из последней пробирки 1мл жидкости вылить. Таким образом, получается следующий ряд разведений исследуемой мочи: в первой пробирке моча исходной концентрации, во 2-ой – разведена в 2 раза, в 3-ей – в 4 раза, в 4-ой – в 8 раз, в 5-ой - в 16, в 6-ой - в 32, в 7-ой – в 64, в 8-ой – в 128.
После разведения мочи произвести поочередное наслаивание содержимого каждой пробирки на концентрированную азотную кислоту. По секундомеру отметить, в какой пробирке белое кольцо образовалось через 2-3 минуты после начала опыта.
Примерный расчет. Между 2-ой и 3-ей минутами белое кольцо образовалось в 5-ой пробирке, где разведение мочи 1:16.
Следовательно, концентрация белка в исходной порции мочи равна:
0,0033% × 16 = 0,05%
8. Определить концентрацию белка в моче по методу Робертса-Стольникова-Брандбсрга.
Количественное определение белка в моче по методу