Не допускается применять тампоны с алгинатом кальция и с деревянной осью.
Для аспирации жидкости везикул используют туберкулиновые шприцы. В каждую емкость с зондом-тампоном при сборе пробы вносят по 3—4 стерильные стеклянные бусинки (d = 5 мм) для снятия материала с тампона.
Кровь собирают в стерильные одноразовые или стеклянные пробирки с антикоагулянтом (гепарин, ЭДТА, цитрат натрия).
Таблица 3
Сбор проб
для культивирования вирусов
| Проба | Способ получения | Вирусы-возбудители | |
| Кровь | Собирают 8—10 мл в емкость с антикоагулянтом | Арбо-, адено-, цито-, мегало-, герпес симплекс-, иммунодефицита человека тип 1 и другие ретровирусы (персистирующие и диссеминированные инфекции у иммунокомпрометированных индивидуумов и новорожденных) | |
| Костный мозг | Собирают не менее 2 мл в емкость с антикоагулянтом | Цитомегаловирус | |
| Жидкости: | |||
| ликвор | Собирают 2—5 мл в стерильный контейнер | Энтеровирусы (коксаки А, В; эхо-, энтеровирусы); герпес, лимфоцитарного хориоменингита, эпидемического паротита, бешенства (может быть полезным для некоторых арбовирусных инфекций) | |
| перикарди-альная | Собирают не менее 2 мл в стерильный контейнер | Коксаки-вирус | |
| слюна | Собирают слюну на 1 или 2 тампона изо рта; помещают тампоны в емкости с транспортировочной средой для вирусов | Вирус бешенства, цитомегаловирус, вирус эпидемического паротита | |
| моча | Собирают 10—12 мл средней порции свободно истекающей мочи в стерильный одноразовый контейнер с завинчивающейся крышкой | Адено-, цитомегало- герпес-, паротита-, полио-, краснухи (2 или 3 порции увеличивают вероятность обнаружения цитомегаловируса – ЦМВ) | |
| Продолжение табл. 3 | ||
| Желудочно-кишечный тракт: | ||
| ректальный мазок | Вводят тампон на глубину 4—6 см per rectum и вращают вокруг оси; извлекают и помещают тампон в емкость с транспортировочной средой для вирусов | Адено-, энтеро-, (коксаки А, В; эхо-, энтеровирусы), герпес (полезны при диагностике проктитов) |
| фекалии | Собирают 2—4 г (примерно 3 ложечки) в специальный одноразовый стерильный контейнер; если сразу нет возможности передать в лабораторию, добавляют 8—10 мл транспортировочной среды для вирусов с целью предотвращения пробы от высыхания. Пригодна проба, собранная в забуференный физиологический раствор с глицерином (как на «дизгруппу») | Адено-, энтеро-, (коксаки А, В; эхо-, энтеро-, полио-вирусы); реовирус |
| Мочеполовая система: | ||
| цервикаль-ный тампон | Удаляют тампоном экзо-цервикальную слизь; вводят новый тампон не менее чем на 1 см в цервикальный канал, и вращают вокруг оси в течение 10 с; извлекают тампон и помещают его вемкость с транспортировочной средой для сохранения вирусов | Герпес-, цитомегаловирусы |
| мазок из уретры | Удаляют любой экссудат; вводят легкий, подвижный тампон (уретральный) на 2—3 см в уретру; осторожно 2—3 движениями вращают тампон вокруг оси и осторожно извлекают. Пациент до процедуры не должен мочиться в течение 1 ч | |
| сперма | Собирают в стерильный одноразовый контейнер с завинчивающейся крышкой | |
| Кожные поражения: | ||
| мазок на зонде-тампоне | Обрабатывают везикулу физиологическим раствором; разрушают везикулу и собирают жидкость зондом-тампоном; тем же самым зон- | Коксаки А вирус, эхо-, герпес-, покс-, герпес зостер- вирусы |
| дом-тампоном собирают клетки основания везикулы. При отсутствии везикул собирают клетки с основания очага, используя тампон, предварительно смоченный стерильным физиологичес-ким раствором. Помещают зонды-тампоны в емкость с транспортировочной средой для сохранения вирусов | ||
| аспираты из везикул | Обрабатывают очаг стери-льным физиологическим раствором; аспирируют жидкость из везикулы иглой 26—27, присоединенной к туберкулиновому шприцу, и немедлено промывают шприц 1—2 мл транспортировочной среды для сохранения вирусов | Предпочтительно для вируса герпес зостер |
| Поражения слизистых оболочек: | ||
| мазок на зонде-тампоне | Тампонируют очаг, двигая зонд-тампон назад и вперед по поверхности очага; помещают тампон в емкостьс транспортировочной средой для сохранения вирусов | Оральные: коксаки А, вирус герпеса. Аногенитальные: вирус герпеса |
| Глаза: | ||
| мазок с конъюнктивы | Тампонируют нижнюю конъюнктиву с помощью подвижного изящного тампона, предварительно смоченного стерильным физиологическим раствором. Помещают зонд-тампон в пробиркус транспортировочной средой для сохранения вирусов | Адено-, коксаки А, цитомегало-, энтеро(тип 70)-, герпес-, болезни Ньюкасла вирусы |
| соскобы | Помещают соскобы, полученные тампоном-щеточкой, в емкость свирусной транспортировочной средой | |
| Дыхательные пути: | ||
| мазки со слизистой носа | Вводят изящный подвижный зонд-тампон в ноздрю, вращают тампон и оставляют его в ноздре в покое на несколько секунд, чтобы абсорбировать | Адено-, цитомегало-, энтеро-, герпес-, грипп-, кори-, парагрипп-, бешенства-, риносинсициальный-, краснухи-, герпес зостер вирусы |
| секреты; помещают тампон в емкость с вирусной транспортировочной средой. Для каждой ноздри используют разные тампоны. Оба тампона помещают в одну емкость со средой | Особенно полезны для обнаружения риновирусов | |
| мазки со слизистой носоглотки | Вводят тонкий подвижный тампон через ноздрю в носоглотку и вращают его вокруг оси очень мягко несколько раз. Помещают тампон в емкость с транспортировочной средой для вирусов | |
| мазки со слизистой ротоглотки | Используют стерильный шпатель, чтобы прижать язык и не контаминировать зонд-тампон слюной. Собирают материал, поочередно обрабатывая тампоном правую и левую миндалины и заднюю стенку глотки. Помещают тампон в емкость с транспортировочной средой для сохранения вирусов | Мазки из ротоглотки используют преимущественно для обнаружения вирусов гриппа, парагриппа, риносинсцитиального, а также адено-, цитомегало-, энтеро-, кори-, бешенства, краснухи-, герпес, зостер вирусов |
| Жидкости: | ||
| бронхо-альвеолярный лаваж | Собирают 8—10 мл в стери-льный одноразовый кон-тейнер с завинчивающейся крышкой | Перечисленные выше |
| носоглоточный аспират | Используют приспособления для сбора слизи (отсосы), вводят через нос в носоглотку катетер соответствующего размера; отсасывают материал во время удаления катетера. Разводят аспират 5—8 мл среды для сохранения вирусов и переносят материал в стерильную пробирку (одноразовую или стеклянную) | |
| плевральная | Собирают не менее 2 мл жидкости в стерильный одноразовый контейнер или стерильную стеклянную пробирку | Вирус косаки В |
| Ткани | ||
| Помещают маленькие пробы (легочный биоптат, например) в емкость с вирусной транспортировочной средой | Из тканей могут быть выделены практически все перечисленные ранее виды патогенных для человека вирусов | |
| для сохранения вирусов и предотвращения пробы от высыхания. Помещают большие пробы (1—2 г, например, при аутопсии) в стерильный одноразовый контейнер, в который добавляют 8—10 мл транспортировочной среды для сохранения вирусов при высыхании пробы | ||
| Мозг | ||
| Изложено выше | Арбовирусы, бешенства и другие вирусы, которые могут вызывать энцефалиты, включая вирус герпеса. Все вирусы, перечисленные ранее | |
| Другой материал | ||
| в зависимости от подозреваемого агента и патологических находок | Изложено выше | Для определения необходимы полные клинические данные, анамнез, оформленная история болезни, из которой можно получить необходимую информацию |
7.3. Пробы биоматериала
для определения наличия простейших
7.3.1. Общие положения. Пробы биоматериала для проведения паразитологических исследований направляют в лабораторию:
¨ при наличии клинических показаний (аллергические проявления, инфекционно-воспалительное заболевание неясной этиологии), подтвержденных в ряде случаев высокой эозинофилией в общем анализе крови;
¨ при обследовании декретированных контингентов (работники общепита, детских образовательных учреждений, плавательных бассейнов и др.);
¨ при плановом обследовании населения.
Для лабораторного подтверждения (постановки) диагнозов «гельминтоз», «протозооз» служат различные виды проб биологического материала, получаемые от обследуемого из желудочно-кишечного тракта, мочеполовой и центральной нервной систем, крови, нижних дыхательных путей, глаз, кожи.
Необходима дифференциальная диагностика паразитарных инфекций и патологических процессов другой этиологии из-за частого отсутствия у больного специфической симптоматики, широкого распространения паразитов по организму, особенно у иммунокомпрометированных больных, тяжести течения заболевания и вероятностью летального исхода при отсутствии четкой диагностики.
Указанное требует от медицинских работников знания и владения правилами и техникой получения пробы (подготовка обследуемого; время отбора и доставки пробы в лабораторию; емкости, используемые для сбора и транспортирования пробы; использование консервантов и маркировка проб биоматериалов).
7.3.2. Биологический материал и встречающиеся в нем гельминты и простейшие – возбудители воспалительных процессов в различных органах и тканях организма.
Таблица 4
| Система, орган, проба | Правила сбора пробы клинического материала и доставки его в лабораторию | Возбудитель |
| Желудочно-кишечный тракт: | ||
| Фекалии | В подготовку обследуемого включают устранение имеющихся запоров с использованием солевых или растительных слабительных. Перед сбором пробы не следует использовать антидиарейные препараты, минеральное масло, висмут, барий, активированный уголь, т. к. эти вещества влияют на процесс идентификации паразитов. Барий окрашивает фекалии в светлые тона или белый цвет; железо, активированный уголь и некоторые антидиарейные препараты могут приводить к появлению темных или черных (дегтеобразных) фекалий и маскировать кровотечение в верхних отделах желудочно-кишечного тракта; желтоватые фекалии – показатель мальабсорбции и часто метка присутствия Giardia lamblia. | Ancylostoma spp; Ascaris lumbricoides; Clonorchis sinensis; Dicrocoelium lanceatum; Enterobios vermicularis; Fasciola hepatica; Metagonimus jokogawai; Nanophyetus shikhobalowi; Necator americanus; Opisthorchis felineus; Paragonimus spp – можно обнаружить Shistostoma mansoni a. spp; Strongyloides stercoralis, fuellebomi; |
| Продложение табл. 4 | ||
| Посуду для сбора пробы получают в лаборатории. Это –чистая (прокипяченная) сухая стеклянная банка или одноразовая с широким горлом и плотно закрывающимися крышками. Стерильная посуда требуется для исследования на амебиаз. Фекалии – утреннюю порцию – после дефекации собирают в посуду из разных участков в объеме от чайной до столовой ложки (не менее 50 г). Избегают контаминации пробы мочой и/или водой. Пробы доставляют в лабораторию в полиэтиленовом мешке не позднее 1—2 ч после дефекации. При отсутствии возможности доставки пробы в лабораторию в указанные сроки или ее исследования в день дефекации получают посуду с консервантом, в которую собирают пробу. Материал хранят при температуре 4—8 °C | Tominx aerophilus; Trichostrongylidae spp; Balantidium coli; Cryptosporidium parvum; Entamoeba coli, hartmanni, histolytica; Isospora spp; Lamblia intestinalis | |
| Перианальная область | В подготовку обследуемого включают инструктаж (если обследуют ребенка, то инструктируют родителей) по правилам сбора материала и доставке его в лабораторию, предупреждение о необходимости сбора проб рано утром, когда пациент только проснулся, до дефекации и душа (обследуемому не следует подмываться или принимать душ и вечером накануне отбора пробы – соскоба с перианальных складок), т. к. паразиты откладывают яйца на коже в течение ночи. Посуду накануне получают в лаборатории: одноразовую | Enterobios vermicularis; Entamoeba histolytica – в соскобах с язв перианальной области |
| пробирку с тампоном (тубсером) или чистую специально смонтированную стеклянную пробирку с ватным тампоном, смоченным в глицерине; или тампоном на шпателе, смоченным в глицерине; или другую специально подготовленную чистую стеклянную посуду; или (особенно при массовых обследованиях населения, в основном, детского) чистые предметные стекла с липкой лентой. Утром собирают соскоб с перианальных складок вокруг ануса методом «смыва» указанными выше тубсерами, тампонами, шпателями или методом «отпечатка» с помощью липкой ленты. В последнем случае перед взятием соскоба отклеивают полоски липкой ленты от предметного стекла; держа полоску за концы, плотно прижимают всей липкой поверхностью к анусу и перианальным складкам, не касаясь пальцами перианальной области. Отклеивают полоску от кожи перианальной области и переносят на предметное стекло липким слоем вниз, приклеивают к стеклу равномерно для избежания образования пузырьков воздуха, мешающих микроскопии. Концы ленты, выходящие за края стекла, отрезают. После сбора пробы тубсеры, тампоны и шпатели помещают обратно в соответствующие пробирки или во флаконы. Пробирки, флаконы, предметные стекла маркируют и передают в лабораторию | ||
| Содержимое 12-перстной кишки | Подготовку обследуемого осуществляют в соответствии с правилами проведения инвазивных мероприятий. Материал (дуоденальное содержимое) получают в результате зондирования. Пробы каждой из трех фракций («А», «В», «С») собирают в отдельные чистые стеклянные химические или центрифужные пробирки, плотно закрывающиеся резиновой или ватно-марлевой пробкой; в одноразовую посуду с завинчивающейся крышкой. При использовании стеклянной посуды с ватно-марлевой пробкой следят за тем, чтобы не замочить пробку биоматериалом в процессе заполнения и транспортирования проб в лабораторию. Доставляют в лабораторию в полиэтиленовом пакете. Рекомендуется собирать материал методом менее инвазивным – Entero-Test Capsula (String Test – струнный тест): обследуемый заглатывает желатиновую капсулу, внутри которой находится нейлоновая струна и грузик; отдыхает 4 ч, после чего струну с адгезированными слизистой и паразитами извлекают. Материал помещают в плотно закрывающийся завинчивающейся крышкой одноразовый контейнер (как правило, для сбора мочи), который немедленно доставляют в лабораторию в пластиковом пакете. При невозможности транспортировать материал в лабораторию в контейнер | Ancylostoma duodenale, Clonorchis sinensis – очень редко; Dicrocaelium dentricum; Fasciola spp; Necator americanus; Opisthorchis felineus; Strongyloides stercoralis; Trichostrongylus colimbriformis; Giardia lamblia; Lamblia intestinalis; Cryptosporidium parvum; Isospora spp. |
| добавляют около 1 мл физиологического раствора для предотвращения пробы от высыхания | ||
| Аспират из 12-перстной кишки | Собирают при наличии эзофагоскопа, или Entero-Test Capsule (String Test – струнный тест) немедлено направляют в лабораторию в плотно закрытом завинчивающейся крышкой одноразовом контейнере (для сбора мочи) или одноразовой плотно закрытой центрифужной пробирке, или определенным образом смонтированной cтеклянной емкости. Емкости с материалом помещают в пластиковый пакет | Strongyloides stercoralis, Giardia lamblia; Cryptosporidium parvum; Isospora belli. В редких случаях – Clonorchis sinensis |
| Слизь, слизис-тая, фекалии и/или комбина-ция всех трех образцов; язвы сигмовидной и ободочной кишки | Собирают в процессе проведения ректороманоскопии у постели больного (в процедурном кабинете) для немедленного просмотра (влажный мазок на чистом обезжиренном или новом предметном стекле). Если пробу доставляют в лабораторию, ее помещают в одноразовую емкость или специально смонтированную стеклянную с добавлением 0,5—1,0 мл физиологического раствора для предотвращения от высыхания | Вышеперечисленные возбудители, преимущественно Entamoeba histolytica, а также Shistostoma mansoni; Balantidium coli; Trichomonas hominis; Trichinella spp |
| Ткани – биоптаты рекомендуется использовать для диагностики тканевых паразитов | Пробы тонкого кишечника Пробы тощей кишки Толстая кишка Пробы 12-перстной кишки | Cryptosporidium parvum; Enterocytozoon bieneusi; Entamoeba histolytica; Shistostoma mansoni и spp; Giardia lamblia |
| Биоптат прямой кишки | Entamoeba histolytica; Balantidium coli; Cryptosporidium parvum | |
| Печень, селезенка | Аспираты и биоптаты органов собирают в 4 (от каждого органа) отдельных одноразовых стерильных контейнера или другие стерильные емкости с герметично закрывающимися крышками, в которых доставляют в лабораторию. Пробы аспирата печени собирают с краев абсцесса, а не из некротического центра | Echinococcus spp; Clonorchis spp, Opisthorchis spp; Toxoplasma gondii; Leishmania donovani; Cryptosporidium parvum; Pneumocystis carinii; Entamoeba histolytica; Fasciola hepatica |
| Мочеполовая система: | ||
| Отделяемое влагалища, уретры, очага на пенисе, соскоб со слизистой уретры, эякулят | Собирают материал платиновой петлей, хлопковым, вискозным или дакроновым зондом-тампоном, или непосредственно с зеркала; готовят мазок на предметном стекле, зонд-тампон, смоченный физиологическим раствором, помещают в пробирку пустую или со средами без угля (типа Эймса или Стюарта или др.), отдельные высушенные на воздухе мазки – для исследования методом иммунофлуоресценции | Trichmonas vaginalis; Shistostoma haemotobium |
| Моча | Собирают первую порцию свободно истекающей мочи в одноразовые контейнер или пробирку, у мужчин – после массажа простаты. Собирают среднюю порцию свободно истекающей мочи, или пробу из суточной мочи, собранной в одноразовые контейнер или пробирку. Среднюю порцию мочи собирают при мочеиспускании с 12 до 15 ч | Trichmonas vaginalis; Shistostoma haemotobium |
| дня, т. к. на это время приходится пик выделения личинок паразита, желательно собрать мочу после физической нагрузки (например, 20—30 приседаний). Собирают также последнюю порцию свободно истекающей мочи при наличии гематурии и обилия слизи. Паразиты определяют у больных с хилурией, с очень тяжелой инфекцией, а также у пациентов, лечившихся диэтилкарбамазином | Микрофилярии, филярии | |
| Биоптат почки | Пробу ткани собирают в стерильную одноразовую емкость с помощью стерильного тампона, пропитанного физиологическим раствором, после того, как этим же тампоном на стерильных предметных стеклах были приготовлены мазки для исследования | Microsporidia |
| Центральная нервная система: | ||
| Ликвор | Пробы ликвора собирают в стерильные одноразовые контейнер или стеклянную пробирку. Передают материал в лабораторию | Naegleria fоwleri; Acanthamoeba и Hartmanella spp; Eshinococcus sp; Toxoplasma gondii; Trypanosoma spp; Tienia soleum |
| Биоптаты | Биоптаты мозга у больных и кусочки ткани, полученные при аутопсии собирают в стерильные одноразовые (стеклянные) контейнер или пробирку, для предотвращения от высыхания добавляют несколько капель стерильного физиологического раствора и направляют в лабораторию | Naegleria fowleri; Entamoeba histolytica; Toxoplasma gondii; Microsporidiа; (Encephalitazoon cuniculi) |
| Кровь | Для микроскопического определения возбудителя получают пробы крови из пальца, | Plasmodium малярии; Babesia spp; Leishmania donovani; |
| сразу же готовят толстый и тонкий мазки на чистом, обезжиренном или новом предметном стекле. Кровь, собранную у пациента натощак при венопункции, помещают в 2 стерильные пробирки по 5—7 мл в каждую (стеклянные, закрывающиеся резиновой пробкой, или одноразовые с плотно закрывающейся пробкой): – в одну пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА, гепарин, цитрат натрия); – во вторую пробирку без антикоагулянта для определения антител к антигенам гельминтов. Емкости с пробами маркируют и направляют в лабораторию | Toxonlasma gondii; Trypanosoma cruzi; Microfilariae Echinococcus sp; Toxocara sp; Opistorchis felineus; Trichinella sp; Toxoplasma sp; Cistecercos sp | |
| Костный мозг | Аспират собирают в стерильные одноразовые (стеклянные) контейнер или пробирку и направляют в лабораторию | Leishmania donovani; Trypanosoma cruzi |
| Нижние дыхательные пути: | ||
| Мокрота откашливаемая | Пробу собирают после объяснения пациенту необходимости почистить зубы, прополоскать рот теплой кипяченой водой и не собирать слюну. В пробу включают любые кровянистые прожилки, включения, слизь. Доставляют в лабораторию в чистом одноразовом контейнере с завинчивающейся крышкой или в соответствующим образом смонтированной стеклянной емкости | Paragonismus sp; Stronguloides stercoralis; Cryptosporidium parvum; Pneumocystis carinii; Ascaris lumbricoides; Tominx aerophylus; Ancylostoma sp; Necator sp |
| Мокрота индуцированная | Индуцирование необходимо, так как у больных с пневмоцистной пневмонией обычно сухой, непродуктивный кашель. | Pneumocystis carinii – наиболее полезны у ВИЧ-инфицированных, у других даже |
| Пробу собирают после проведения пациентом гигиены рта – см. выше. Доставляют в лабораторию – см. выше | при наличии лихорадки, пневмоцисты определяют существенно реже | |
| Лаваж, альвеолярная жидкость, смывы с бронхов | Пробы собирают с помощью бронхоскопа (предпочтительнее лаваж) в специальный стерильный одноразовый контейнер с завинчивающейся крышкой или специально смонтированную стерильную стеклянную посуду | Pneumocystis carinii; Toxoplasma gondii; Cryptosporidium parvum; Paragonismus westermanii; Trichinella spp |
| Аспираты трансбронхи-альные, трахео-бронхиальные, легких | Пробы, собранные тонкой иглой, наносят на чистое, обезжиренное или новое предметное стекло, готовят мазки, высушивают на воздухе, упаковывают и направляют в лабораторию | Pneumocystis carinii; Toxoplasma gondii; Paragonismus westermanii; Trichinella spp; Cryptosporidium parvum; Entamoeba histolytica |
| Биоптаты | Пробы бронхов, полученные специальной щеточкой, или легкого, полученные во время операции, наносят на чистое обезжиренное или новое предметное стекло, готовят мазки, высушивают на воздухе, упаковывают и доставляют в лабораторию. Для культивирования паразитов пробы собирают в специальные контейнеры (консультируйтесь с паразитологом!) | Полезны для диагностики тканевых паразитов как дополнение к стандартным гистологическим ис-следованиям: Pneumocystis carinii; Toxoplasma gondii; Paragonismus westermanii; Entamoeba histolytica; Echinococcus sp; Strongoloides stercoralis; Trichinella spiralis |
| Глаза: | ||
| Биоптаты, соскобы с роговицы и | Пробы собирают в стерильные емкости одноразовые или стеклянные, специально | Acanthamoeba spp; Naegleria fowleri; Microsporidium spp; |
| конъюнктивы; линзы Смыв с линзы | смонтированные, герметично закрывающиеся. Для предотвращения от высыхания добавляют несколько капель стерильного физиологического раствора. Доставляют в лабораторию. Собирают в стерильные емкости одноразовые или специально смонтированные стеклянные, герметично закрывающиеся. Доставляют в лабораторию | Филярии; Toxoplasma gondii; Nosema sp |
| Кожа, ткани: | ||
| Основание (дно) язвы | Аспират собирают в стерильные емкости; параллельно готовят мазки на чистом обезжиренном или новом предметном стекле; материал передают в лабораторию | Leishmania spp |
| Биоптаты тканей (подкожные узлы, клетчатка; фасции; икроножные, дельтовидные мышцы; диафрагма; кожа) | Собирают в стерильные емкости одноразовые или стеклянные, специально смонтированные, герметично закрывающиеся; для предотвращения от высыхания добавляют стерильный физиологический раствор. Доставляют материал в лабораторию | Leishmania sp; Onchocerca volvulus; Mansonella streptocerca; Trichinella spiralis; Paragonismus westermanii; Trypanosoma cruzi; Tienia solium |
| Соскоб с поверхностных поражений кожи | Собирают асептически в специальную стерильную емкость одноразовую или стеклянную, специально смонтированную, герметично закрывающуюся; добавляют стерильный физиологический раствор для предотвращения высыхания; параллельно готовят мазки на чистом, обезжиренном или новом предметном стекле. Доставляют материал в лабораторию | Onchocerca vulvulus; Mansonella streptocerca |
8. Пробы биоматериала и иммуносерологические
методы определения возбудителей
инфекционно-воспалительных процессов
8.1. Общие положения
Проведение иммуносерологических исследований основано на применении технологических приемов (методик), позволяющих определять специфические антигены возбудителей инфекционных, и инфекционно-воспалительных заболеваний, и/или вводимых при вакцинации, и ответной реакции на них организма образованием антител. Это необходимо для объективизации клинического диагноза, результатов терапии, оценки качества вакцинации, своевременной организации и проведения противоэпидемических мероприятий.
Тест-системы, предназначенные для определения специфических антигенов, используются для идентификации конкретного микроорганизма в пробе клинического материала или выращенного in vitro.
С помощью методов, предназначенных для определения антител, дается характеристика ответа организма (человека) на конкретный антиген без учета или с учетом специфического класса иммуноглобулинов (Ig), в котором они находятся. IgM-ранние антитела (4—7 сут. от первичного инфицирования микроорганизмами), IgG-поздние антитела, которые (в зависимости от антигена) могут находиться в организме от 5—7 суток до 3—4 недель (период реконвалесценции) и даже всю жизнь. Сывороточные IgA при всей их вариабельности по срокам образования (11—15 суток) и персистенции в организме (до 30 суток) отражают не столько реакцию на конкретный бактериальный антиген, сколько на деструкцию органа, обусловленную воспалительным процессом микробной этиологии. Уровень секреторного IgA – прогностический признак вероятности развития инфекции на слизистых оболочках при нарушениях микроэкологии, т. е. микробиологического аспекта системы антиинфекционной резистентности (САИР), а также вероятности проникновения (транслокации) возбудителя в другие органы и ткани. Уровень IgE антител увеличивается в ответ на паразитарные инфекции, но специфическая реакция на другие инфекционные агенты в этом классе Ig отсутствует.
Возникновение инфекционного и инфекционно-воспалительного заболевания, течение патологического процесса и эффективность терапии в большой степени зависят от состояния защитных сил организма, т. е. от факторов системы антиинфекционной резистентности, в частности, в ее иммунологическом аспекте. Нарушения в синтезе и функциональной активности терминальных компонентов каскада комплемента (мембран-атакующего комплекса) – фактор, предрасполагающий к развитию рецидивирующих нейссериальных (N. gоnorrhoeae) инфекций. Мутация в рецепторе γ–интерферона – основа тяжелейшей диссеминированной микобактериальной инфекции и фатального исхода от Mycobacterium bovis – основы противотуберкулезной вакцины Кальмет-Герена. Полиморфизм генов человека – основа устойчивости к малярии, а врожденное отсутствие некоторых эритроцитарных антигенов среди определенной человеческой субпопуляции определяет их абсолютную устойчивость к парвовирусам. Недостаточность или нарушения в функционировании бактерицидных систем в клетке нейтрофила и/или в целом в процессе фагоцитоза – основа развития воспалительного процесса, вызванного условно-патогенными микроорганизмами. В настоящее время имеется возможность определения и подсчета количества В-лимфоцитов, активирующих плазменные клетки, образующие антитела, с паралллельным определением специфических антигенов. Для этого используют пробу периферической крови, в которой также определяют вирусы лихорадки Денге, гриппа, респираторно-сенсициального, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).
Учитывая важность иммунологического и микробиологического аспектов системы антиинфекционной резистентности организма в развитии и течении инфекционно-воспалительных процессов, в т. ч. внутрибольничной природы, в научно-практических лабораториях рекомендуется проводить комплексные клинико-микробиологические и иммуно-серологические обследования.
8.2. Иммуносерологическое обследование
Иммуносерологическое обследование включает определение:
¨ антител к эндо- и экзотоксинам, клеточной стенке и ее компонентам микробов-возбудителей воспалительных процессов;
¨ С-реактивного белка (СРБ) и других белков острой фазы как показателей наличия и активности воспаления инфекционной природы;
¨ бактерицидной активности сыворотки (БАС) и/или других жидкостей тела с аутоштаммами пациента; этот тест до назначения антибактериальной терапии свидетельствует о состоянии комплекса гуморальных факторов защиты организма, при наличии антибактериальной терапии позволяет проводить мониторинг ее активности;
¨ иммуноглобулинов M, G, A классов в сыворотке крови и других жидкостях организма как показателя остроты и длительности инфекционно-воспалительного процесса, способности обследованного реагировать на возбудитель, а также как необходимых компонентов, участвующих в фагоцитозе нейтрофилов в качестве опсонинов (IgM, IgG) и показателя наличия деструкции органа (IgА) в результате воспаления;
¨ активности комплемента и его компонентов в качестве субстанции, приводящей к лизису клетки микроорганизма, если комплекс антиген—антитело находится на ее поверхности, и как инициатора выброса нейтрофилов, если комплекс находится в тканях, а также как опсонина;
¨ лизоцима как показателя состояния лейкоцитов, способности организма к лизису грамположительных кокков и в крови – E. coli;
¨ фагоцитарной функции нейтрофилов в незавершенном и завершенном вариантах с контрольными и аутоштаммами, выделенными из очага воспаления;
¨ В-лимфоцитов, учитывая их способность к дифференциации в плазменные клетки и образованию специфических антител в различных классах иммуноглобулинов;
¨ Т-лимфоцитов и их субпопуляций как контролирующих активность В-лимфоцитов и реагирующих с клетками с более низкой степенью специфичности, чем те, с которыми реагируют цитотоксические Т-лимфоциты.
Стерильную посуду для сбора проб и их транспортирования (кровь и другие жидкости организма обследованных) накануне получают в лаборатории.
Иммуносерологические исследования проводят параллельно с микробиологическими, анализирующими материал из очага воспаления, обсемененность слизистой верхних дыхательных путей (нос, зев), гениталий и содержимого кишечника.
Все пробы готовят в один и тот же день: при поступлении, накануне операции или с операционного стола (до операции), на 3—4‑е сутки после операции (2—3-е сутки после госпитализации у терапевтических больных), на 14—16-е сутки после операции (после госпитализации терапевтических больных), перед выпиской из стационара или в сроки, оговоренные клиницистами.
Комплексные исследования с анализом проводят с целью изучения патогенеза воспалительного процесса определенной локализации, вызванного условно-патогенной микрофлорой, которые позволяют установить нарушения в системе антиинфекционной резистентности организма, определить возможность развития внутрибольничной инфекции и реакцию на нее конкретного больного, а также способность пациента реагировать на определенный возбудитель (возбудители), проводить мониторинг эффективности антибактериальной и специфической иммунотерапии и других лечебных мероприятий.
8.3. Методы исследования,
применяемые в иммуносерологии
Выбор оптимального метода определения антигенов и антител зависит от соответствия собранной пробы целям и задачам исследования (сроки от начала заболевания, отсутствие гемолиза и липолиза пробы, контаминации посторонней микрофлорой) и требований к спектру исследований, которые могут быть выполнены в конкретной лаборатории.
Используют следующие методы исследования:
Реакция агглютинации – используют для подтверждения наличия инфекции, вызванной определенным бактериальным антигеном.
Непрямая (пассивная) гемагглютинация (РПГА) с латексными частицами или эритроцитами барана – используют для определения наличия антител к возбудителям кишечных инфекций, в модификации с использованием латексных частиц (диагностикумов) – для диагностики бактериальных менингитов, определения антигенов Candida, гонококков, гемофильной палочки.
Ингибиция гемагглютинации – модифицированная РПГА, используют для определения антител к вирусам краснухи, гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиального.
Преципитация– реакция между растворимыми антигенами и антителами, используют метод диффузии в геле.
Радиальная иммунодиффузия – определение анигенов или антител в моноспецифической системе с чувствительностью 1—10 мг/л, используют для сравнения антигенов (чувствительность – несколько наннограмм/мл).
Электроиммунодиффузия– подобна радиальной, но миграция реагентов направляется электрическим полем, и ее чувствительность в 5—10 раз выше, чем в радиальной иммунодиффузии.
Быстрые методы определения антигена и антител (15—20 мин) – основаны на использовании коллоидных, меченых золотом антител. Определяют антитела к ВИЧ и антиген хламидии трахоматис. Диагностику лихорадки Денге осуществляют с помощью иммунохроматографического определения сывороточных IgM и IgG.
Методы с меченными антителами – специфичные высокочувствительные методы для определения антигенов в клетках и тканях: прямая (ПИФ) и непрямая (НИФ) иммунофлуоресценция, а также антигенов микроорганизмов. Используют для определения кластеров дифференциации и антигенов на поверхности лимфоцитов. Можно определять антигены в мазке материала (инфекции, передаваемые половым путем). С использованием прямой иммунофлуоресценции определяют антиген в количестве не менее 105 микробных тел. Непрямая иммунофлюоресценция в 5—10 раз чувствительнее, чем прямая.
Радиоиммунологические (метка – 125I) исследования (РИА) и ELISA-ИФА (метка-фермент: пероксидаза хрена) – каждый из методов используют для количественного определения конкретного антигена в растворе даже при наличии смеси антигенов. Применяют для идентификации вирусов (герпес симплекс, ЦМВ, герпес зостер), возбудителей коклюша (Bordetella pertussis), бруцеллеза (Brucella abortus) в мазке материала – пневмонии (Legionella pneumophyliae, Mycoplasma pneumoniae), болезни Лайма (Borrelia burgdoferi), сифилиса (T. pallidum), ИППП (Chlamidia spр, Ureaplasma spр), кишечных инфекций (Salmonella spр, Shigella spр), Streptococcus гр. А, Toxoplasma gondii, Helicobacter pylori – в крови. Чувствительность методов – 1—2 нг/мл. Альтернативный метод – иммуноблоттинг, используемый для мониторирования инфекций, вызванных ВИЧ, вирусами гепатита, T. рallidum, Borrelia burgdoferi (чувствительность – 1—2 нг/мл) и других.
Мечеными конъюгатами определяют и мониторируют ответ (выработка антител) на антигены вирусов (ВИЧ, ЦМВ, герпес симплекс, герпес зостер), T. рallidum, B. burgdoferi.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и различные модификации на ее основе (методы гибридизации ДНК и РНК) – основана на замене биологической амплификации (накопление клеток микроорганизма при культивировании in vitro) на ферментативную (энзиматическую) амплификацию специфических последовательностей нуклеиновых кислот возбудителя. Гибридизация нуклеиновых кислот возбудителя позволяет определять гены, ответственные за антибиотикорезистентность, наличие в биопробе медленно растущих и требующих особых условий культивирования микроорганизмов (например, легионеллы и микобактерии), тех, которые невозможно культивировать in vitro (возбудитель болезни Уиппла—Tropheryma whippelii и др.).
8.4. Сбор и хранение образцов
для ПЦР-диагностики
Материалом для исследования служат: соскоб из уретры, цервикального канала, заднего свода влагалища, секрет предстательной железы, сперма, моча, мазки с коньюнктивы.
8.4.1. Сбор материала (соскоб из урогенитального тракта) у женщин. Соскобы производят из трех различных точек: цервикальный канал, уретра, задний свод влагалища. При необходимости материал для исследования берут из эрозивно-язвенных поражений. Сбор материала производят отдельными одноразовыми стерильными зондами.
8.4.1.1. Сбор материала из цервикального канала. Удаляют слизь с поверхности шейки матки тампоном, вводят зонд в цервикальный канал на 1,0—1,5 см и вращают его в течение 3—5 с. Извлекают зонд, избегая касания стенок влагалища, и помещают его в стерильную одноразовую пробирку с транспортировочной средой (0,3 мл). Погрузив рабочую часть зонда в транспортировочную среду, вращают зонд в течение 10—15 с, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.
8.4.1.2. Сбор материала из уретры. Перед забором соскоба из уретры необходимо обработать ее наружное отверстие тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором. Производят массаж уретры пальцем со стороны влагалища, прижимая ее к лобковой кости. Вводят зонд в уретру на глубину 1,0—1,5 см и аккуратно, не поранив слизистую, несколькими вращательными движениями производят соскоб эпителиальных клеток и переносят зонд в пробирку с транспортировочной средой (0,3 мл). Погрузив рабочую часть зонда в транспортировочную среду, вращают зонд в течение 1,0—15 с, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.
8.4.1.3. Сбор материала из заднего свода влагалища. В случае избытка слизи и обильных выделений их удаляют стерильным ватным тампоном. Проводят зондом по поверхности слизистой в области заднего свода влагалища и эктоцервикса и переносят зонд в пробирку с транспортировочной средой (0,3 мл). Погрузив рабочую часть зонда в транспортировочную среду, вращают зонд в течение 10—15 с, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.
8.4.2. Сбор материала (соскоб из урогенитального тракта) у мужчин.
8.4.2.1. Сбор материала из уретры. Перед сбором соскоба из уретры необходимо обработать головку полового члена в области наружного отверстия уретры тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором. Производят массаж уретры. При наличии свободно стекающих из уретры выделений удаляют их сухим тампоном. Вводят зонд в уретру на глубину 3—4 см. Несколькими вращательными движениями производят соскоб эпителиальных клеток и переносят зонд в пробирку с транспортировочной средой. Погрузив рабочую часть зонда в транспортировочную среду, вращают зонд в течение 10—15 с, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.
8.4.2.2. Сбор секрета предстательной железы может быть осуществлен двумя способами:
¨ первый – после окончания массажа предстательной железы ее секрет в количестве 0,5—1,0 мл собирают в одноразовую стерильную пробирку объемом 1,5 мл;
¨ второй – при невозможности получить секрет сразу после массажа собирают первую порцию мочи (в которой содержится секрет предстательной железы) в количестве 10 мл (см. правила забора мочи).
8.4.2.3. Сбор спермы осуществляют в стерильные одноразовые флаконы или пробирки.
8.4.3. Сбор проб мочи. Для анализа отбирают первую порцию утренней мочи в количестве не меньше 20—40 мл в специальный сухой стерильный флакон или сухую стерильную пробирку.
8.4.4. Сбор проб с конъюнктивы. Сбор пробы осуществляют сухими стерильными ватными тампонами под местной анастезией (2 капли раствора дикаина или инокаина). Оттянув нижнее веко, вращающими движениями провести зонд 4—5 раз по конъюнктиве, захватывая внешний и внутренний углы глаза. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с транспортировочной средой. Погрузив рабочую часть зонда в транспортировочную среду, вращают зонд в течение 10—15 с, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.
8.5. Сбор проб для диагностики сифилиса
8.5.1. Влажные поражения:удаляют корочку с очага, далее необходимо промокнуть любой экссудат вторичной инфекции стерильной марлевой салфеткой, придавливают основание очага для накопления тканевой жидкости на его поверхности, прикладывают обезжиренное или новое предметное стекло к экссудату или собирают жидкость стерильной бактериологической (одноразовой или металлической, обожженной в пламени спиртовки и остуженной на воздухе) петлей и переносят жидкость на стекло, готовят мазки.
8.5.2. Сухие поражения кожи: осторожно удаляют поверхностный слой кожи с помощью стерильных скальпеля, кончика иглы или проводят механическую экскориацию, прижимают очаг, если это необходимо, и собирают экссудат (см. выше). Материал можно собрать, введя в основание очага небольшое количество стерильного небактериостатического физиологического раствора, отсасывают жидкость шприцем с тонкой иглой, готовят мазок (см. выше).
8.5.3. Цервикально-вагинальные очаги: пробу собирают, используя зеркало для определения локализации очага, удаляют любое отделяемое из вагины и цервикального канала с помощью стерильного тампона, используя стерильную бактериологическую петлю (см. выше), собирают серозный экссудат. При необходимости прижимают очаг (поражение) специальным зажимом для получения серозного экссудата, готовят мазки.
8.5.4. Сифилитические пятна на слизистых оболочках: собирают материал со слизистых носа, глотки, полости рта или кишечника с помощью стерильной бактериологической петли (см. выше) и готовят мазки.
8.5.5. Лимфоузлы: если сифилитические очаги лечили местным применением антибиотиков, то трепонемы могут быть разрушены. В этих случаях проба из лимфоузла – единственный материл для получения корректного результата исследования. Необходимо обработать кожу над узлом, тампонируя 70 %-м этиловым спиртом, а затем 1—2 %-м раствором йода или другого дезинфектанта. Крепко держат узел и вводят в него стерильную иглу, присоединенную к шприцу, содержащему не более 0,2 мл небактериостатического физиологического раствора. Вводят раствор в лимфоузел и осторожно поводят в нем иглой в разных направлениях для разрыхления ткани. Отсасывают шприцем жидкость и отделяемое и переносят его на стекло для немедленного исследования.
8.5.6. Жидкости тела, экссудаты поражений, суспензии мацерированной ткани и другой материал: тщательно перемешивают эти жидкости и суспензии стерильной пипеткой с резиновой грушей для уверенности в равномерном распределении материала.
При приготовлении мазков необходимо на чистое обезжиренное или новое предметное стекло нанести материал на площадь диаметром 1 см. Мазки высушивают на воздухе. Если возможно, необходимо из каждой пробы приготовить по 4 мазка. До передачи в лабораторию мазки следует зафиксировать в ацетоне в течение 10 мин или легким нагреванием над пламенем спиртовки. Стекло каждого пациента, независимо от используемого метода, фиксируют отдельно.
8.5.7. Биопсии тканей и материал, полученный при аутопсии, анализируют в отделе патоморфологии параллельно с гистологическим исследованием.
8.5.8. Пробы для серологических специфических и неспецифических для Т. pallidum тестов: кровь собирают венопункцией.
Таблица 5
Иммуносерологические методы
в идентификации некоторых возбудителей
и ответной реакции на них пациента
| Микро- организм-возбудитель пробы | Клинические проявления заболевания, обусловленные конкретным возбудителем | Методы, используемые для определения | |
| бактериальной клетки (антигена) | гуморального ответа пациента (антител) | ||
| Mycoplasma pneumoniae пробы: кровь; жидкости: | Первичная атипичная пневмония; трахеобронхит; фарингит; осложнения в органах вне дыхательных | Прямая иммунофлуорес- ценция (ПИФ); | Специфические антитела IgG, IgM; |