У пробірку вносять п'ять крапель розчину гліцину та дві краплі розчину
нінгідрину. Вміст пробірки старанно перемішують на водяній бані за
температури 70°С протягом 5 хв. У пробірці з'являється синьо-фіолетове
забарвлення.
Б. Хід роботи.
До 1 мл розчину яєчного білка^додають три краплі розчину нінгідрину.
Суміш перемішують і ставлять на водяну баню за температури 70°С на 5
хвилин. Спостерігають утворення синьо-фіолетового забарвлення, яке
свідчить про наявність у молекулі білка залишків а-амінокислот.
Дослід 10.3Реакція Адамкевича на триптофан.
Принцип методу.Триптофан у кислому середовищі вступає в реакцію з гліоксиловою кислотою (альдегідами), утворюючи забарвлені в червоно-фіолетовий колір продукти конденсації:
Матеріали та реактиви.
Водний 0.01% розчин триптофану, льодова оцтова кислота,
концентрована сірчана кислота.
Обладнання.
Пробірки градуйовані, піпетки, штатив для пробірок, водяна баня,
годинник.
Хід роботи.
До 0.5 мл розчину триптофану додають 0.5 мл льодової оцтової кислоти, яка завжди містить невелику кількість гліоксилової кислоти. Одержану суміш спочатку нагрівають, а потім охолоджують і по стінці пробірки обережно, по краплинам, щоб рідини не змішувалися, додають 1 мл концентрованої сірчаної кислоти. Через 10 хв на межі розподілу двох шарів утворюється червоно-фіолетове кільце. Реакцію можна прискорити, якщо поставити пробірку з реагуючою сумішшю в киплячу водяну баню.
Дослід 10.4Визначення тирозину, гістідіну і триптофану за
допомогою діазореакцій.
10.4 (1) Реакція Вуазене на триптофан.
Принцип методу.Триптофан, конденсуючись з формальдегідом, утворює забарвлений продукт конденсації біс-2-триптофанілметан, який окислюється до біс-2-триптофанілкарбоніду.
За наявності мінеральних кислот біс-2-триптофанілкарбінол утворює солі, які забарвлені в синьо-фіолетовий колір.
Матеріали та реактиви.
Водний 0.01% розчин триптофану, водний 2.5% розчин формальдегіду,
концентрована сірчана кислота, 0.5% розчин нітриту натрію. Обладнання.
Скляні палички, пробірки градуйовані, піпетки, крапельниці, штатив для пробірок, годинник, ванночка з льодом.
Хід роботи.
До 2 мл розчину триптофану додають одну краплю розчину формальдегіду, суміш перемішують і вливають порціями по декілька крапель 6 мл концентрованої сірчаної кислоти, охолоджуючи пробірку у ванночці з льодом. Суміш знову перемішують і дають відстоятися 10 хв. Потім, перемішуючи суміш, у пробірку вносять 10 крапель розчину нітриту натрію; з'являється інтенсивне синьо-фіолетове забарвлення.
10.4 (2) Реакція Паулі на гістидин і тирозин.
Принцип методу.
Під час взаємодії сульфанілової кислоти з нітритом натрію (калію) в кислому середовищі відбувається реакція діазотування. Її продуктом є діазобензол-сульфонова кислота, яка в реакції з гістидином (чи тирозином) утворює комплексну сполуку вишнево-червоного кольору:
Матеріали та реактиви.
Водний 0.01% розчин гістидину, 1% розчин сульфонілової кислоти в 5% розчині соляної кислоти, 0.5% розчин нітриту натрію, 10% розчин карбонату натрію.
Обладнання.
Скляні палички, пробірки градуйовані, піпетки, штатив для пробірок.
Хід роботи.
До 1 мл розчину сульфонілової кислоти додають 2 мл розчину нітриту натрію, перемішують, негайно доливають 2 мл розчину гістидину, знову ретельно перемішують і додають 6 мл розчину карбонату натрію. Після перемішування розчин забарвлюється в червоно-вишневий колір.
Дослід 10.5Діаліз сольового розчину білка.
Принцип методу.
Метод діалізу грунтується на здатності малих за геометричним розміром
молекул (кристалоїдів) дифузно проникати через напівпроникні мембрани та на відсутності цієї здатності в макромолекул (колоїдів). Білки – це високомолекулярні колоїдні речовини, які не дифундують через полупроникні мембрани (наприклад, колодієва чи целофанова плівка).
Цю властивість покладено в основу очищення білків від низькомолекулярних органічних і молекулярних домішок.
Матеріали та реактиви.Целофанові чи колодієві мішечки, 1% розчин нітрату срібла, 10% розчин гідроксиду натрію, 1% розчин сульфату міді
Обладнання.Скляні палички, пробірки, крапельниці, градуйовані піпетки, діалізатор (чи скляний стакан об'ємом 0.5 л), штатив для пробірок.
Хід роботи.
Спочатку за допомогою біуретової реакції визначають, чи містить досліджувальний розчин білок. До десяти крапель розчину білка додають три краплі 10% розчину гідроксиду натрію, одну краплю 1 % розчину сульфату міді. Одержану суміш ретельно перемішують. Червоно-фіолетове забарвлення свідчить про наявність у розчині білка. Целофановий (колодієвий) мішечок заповнюють на 1\3 1% розчином досліджувального білка і вміщують у діалізатор з дистильованою водоют (чи в скляний стакан з водою), затискуючи його верхній край двома скляними паличками, які скріплені гумовими кільцями. Через 1,5 години із діалізатом (зовнішня рідина) та дистильованою водою, яка використовувалася для діалізу, здійснюють реакцію виявлення хлоридів. Готують дві пробірки, в одну з них додають 1 мл дистильованої води, в іншу - 1 мл діалізату, потім по одній краплі 10% розчину азотної кислоти та 1% розчину нітрату срібла. В пробірці, яка містить діалізат, спостерігають випадіння білого осаду хлориду срібла. В пробірці з дистильованою водою такого осаду немає. Роблять висновок, що під час діалізу сольового розчину білка хлориди проникли в діалізат через напівпроникну мембрану.
Питання до експериментальної частини
1. Як проводять визначення ізоелектричної точки білків? В чому полягає принцип методу?
2. Як можна довести наявність пептидних зв'язків у молекулах білків?
3. За допомогою яких якісних реакцій можна визначити тирозин, гістидин, тріптофан?
4. Як визначають азот в тваринних тканинах за допомогою метода ФЕК?
5. В чому полягає суть рефрактометричного виявлення білків у біооб'єктах?
6. Як проводиться кількісне визначення білків?
7. В чому полягає суть діалізу білків?
ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 11