Сопряжение процессов деструкции лигнина и полисахаридов
Лигнинразрушающие грибы, как правило, разрушают лигнин одновременно с углеводными компонентами растительного сырья. Содержание лигнина снижается пропорционально снижению уровня легкогидролизуемых веществ. Скорость потребления лигнина значительно ниже использования полисахаридов, продуктов деструкции лигнина и недостаточна для жизнедеятельности клеток, что приводит к уменьшению микробного воздействия на субстрат.
Полагают, что набор и активность экзоферментов грибов, оказались одним из первостепенных коадаптивных биохимических механизмов, определяющих стратегию коэволюции грибов и растений на раннем этапе. От особенностей ферментативного комплекса, характерного для конкретного штамма гриба, в значительной степени зависит интенсивность и степень разложения растительного субстрата.
Разложение лигнина и целлюлозы у высших базидиомицетов - биохимически сопряженные процессы. Известно, что расщепление лигнина в лигноцеллюлозе происходит значительно быстрее, чем деградация выделенного, очищенного от целлюлозы, лигнина. В процессе разложения веществ разной степени атакуемости соблюдаются соокислительные условия и отсутствие, хотя бы одного участника процесса нарушает весь деградационный процесс лигноцеллюлозного субстрата.
Для эффективного разложения лигнина требуется наличие сахара в качестве источника энергии для роста и метаболизма деструкторов и частично для образования пероксида водорода, необходимого для лигнинпероксидазы и реакций окислительной деструкции лигнина. Основными растворимыми продуктами разложения целлюлозы, как известно, являются целлобиоза и глюкоза. Последняя превращается в глюконолактон и пероксид водорода.
Взаимная регуляция биохимических циклов превращения лигнина и целлюлозы может осуществляться несколькими путями:1. через катаболизм углевода, который обеспечивает возможность поддержания жизнеспособности деструкторов на стадии вторичного метаболизма. 2. на стадии генерации пероксида водорода для лигнинпероксидазы и Mn-пероксидазы оксидазами сахаров. 3. через регенерацию низкомолекулярного медиатора в сопряженной системе лакказа : пероксидаза : целлобиозодегидрогеназа.
У гриба Phanerochaete chrysosporium, ферменты, в результате действия которых образуются растворимые углеводы, сходны с полисахаридгидролазами Trichoderma reesei. Из внеклеточных ферментов, участвующих в сопряженных процессах деструкции целлюлозы/ лигнина и образующих перекись водорода, важная роль принадлежит глюкозооксидазе, пиранозо-2-оксидазе, синтезируемых грибом в условиях роста на глюкозе. При росте гриба на целлюлозе или древесине синтезируется внеклеточный фермент целлюлозодегидрогеназа, которая может усиливать действие Mn-пероксидазы путем восстановления окисленной формы Mn3+.
Имеются сведения о том, что фенольные соединения, образующиеся в процессе деградации лигнина, могут репрессировать синтез целлюлаз, а также вызывать инактивацию этих ферментов. Репрессирующим действием обладали ванилин, ванилиновая кислота, ванилиновый спирт, сиреневый альдегид, гидроксибензиловый спирт, синаповая кислота. Считается, что микроорганизмы конститутивно ситезируют независимо от источника углерода в питательной среде низкий базальный уровень целлюлаз, которые, воздействуя на целлюлозу, обеспечивают культуру низкомолекулярными растворимыми эффекторами индукции.
Одним из способов проявления взаимосвязи процессов разложения целлюлозы и лигнина являются и реакции трансгликозилирования .
На рис.45. представлена схема сопряженной деградации целлюлозы и лигнина, предложенная К.Э. Эриксоном и др.
Рис.45. Микробная деградация целлюлозы и лигнина
Процессы деструкции природных лигноцеллюлозных субстратов, имеющих разное соотношение лигнина, целлюлозы, гемицеллюлоз, пектиновых веществ микроорганизмами, характеризующихся разнообразным сочетанием, качественным и количественным набором ферментов, участвующих в этом процессе, различаются и имеют своеобразные проявления. Поэтому важно выявить пути и причины, обуславливающие своеобразные деструктивные процессы в конкретных условиях и для конкретных микроорганизмов.
Имрановой (1998) экспериментально доказано, что интенсивность деградации естественных древесных растений (опад, кора) значительно выше, чем разложение антропогенных растительных отходов (опилки, гидролизный лигнин). Независимо от вида древесных остатков при их деградации сохраняются общие закономерности сукцессионного распределения основных эколого- трофических групп микроорганизмов. Так деструкция гидролизного лигнина протекает более эффективно под воздействием микробной ассоциации, чем при участии активной монокультуры. Подобранная ассоциация микроорганизмов осуществляет деструкцию за счет разрыва эфирных связей, ароматического кольца лигнина и по-видимому С-С связей. При раскрытии бензольного кольца образуются нетоксичные для растений низкомолекулярные жирные, оксикарбоновые, дикарбоновые и ароматические кислоты.
Грибы гумифицирующие растительные остатки, так же как и грибы, развивающиеся только на древесине синтезируют помимо полисахаридгидролаз, оксидазы сахаров, образующих перекись водорода и лакказы, которые. участвуют как в разложении лигнина, так и в образовании гумуса. Лакказы гумификаторов имеют оптимум рН близкий к нейтральному, в отличие от лакказ дереворазрушающих грибов, имеющих оптимум окисления фенольных субстратов при рН 4,0-5,0. Считают, что отличие кислых и нейтральных лакказ заключается в их предназначении. Кислые лакказы выполняют важную роль при свободнорадикальном разрушении лигнина и при рН близком к нейтральному они становятся менее активны, что свидетельствует о том, что они предназначены для деградации, а не для конденсации. Нейтральные лакказы специализированы, очевидно, для полимеризации низкомолекулярных фенолов и детоксикации катехинов, лигнанов, танинов путем их конденсации с углеводами, аминокислотами и в результате гумификации.
В почве лигнинразрушающие ксилотрофы и грибы, населяющие лесной опад и подстилку активно деполимеризуют и потребляют гуминовые кислоты. При этом в процессе деполимеризации накапливаются растворимые в кислой среде соединения, сходные с фульвокислотами и происходит значительное (до 50%) декарбоксилирование гуминовых кислот. Ключевым ферментом для этого является грибная Mn-пероксидаза, которая действует через низкомолекулярный диффундирующий медиатор с высоким редокс-потенциалом – хелатированный ион Mn(III). Активность Mn-пероксидазы в почве может сохраняться неизменной в течение нескольких дней. Этот способ мобилизации почвенного углерода, азота и других компонентов, может использоваться сапрофитными грибами белой гнили, образующими почвенный мицелий.
Селективная деструкция лигнина осины, лиственницы и ароматических соединений, моделирующих структурные звенья лигнина древесины, была обнаружена Медведевой (1995,1996), у Phanerochaete saguinea и Trametes villosus. Установлено, что биодеградация лигнинов осины и лиственницы происходит за счет однотипных реакций (рис.46).
Рис.46. Окислительные реакции в лигнине в результате воздействия грибов Phanerochaete saguinea и Trametes villosus (Медведева, 1995).
Окислению подвергаются Сα, Сγ атомы пропановой цепи, как в низко -, так и высокомолекулярных составляющих лигнина. В макромолекуле происходит разрыв алкиларильных, ариларильных, С-С связей алифатической цепи, возможен разрыв С-С связей ароматического кольца.
Наряду с окислением протекает реакция деметоксилирования и происходят in vivo реакции поликонденсации радикального типа по 2,6 и преимущественно 5 положениям бензольного кольца, в том числе, с участием свободных фенольных гидроксильных групп, а так же Сα, Сβ атомов в случае пропениларильных фрагментов, с образованием С-С и С-О-С связей. Конкуренция процессов поликонденсации и деструкции происходит до полного замещения фенольных гидроксилов, после чего преобладают процессы деструкции. Деструкция лигнина грибом Trametes villosus происходит быстрее, он за 7 суток роста разрушает 57% лигнина древесины осины, а Phanerochaete saguinea за 15 суток воздействия только 38%. Кроме того, биодеструкция лигнина осины грибом Phanerochaete saguinea начинается с окисления его низкомолекулярных компонентов, а на 15-25 сутки роста окислению подвергаются высокомолекулярные составляющие. Гриб Trametes villosus окисляет одновременно как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные составляющие.
Биодеградация вератрилпропановых субстратов грибом Trametes villosus сопровождается окислительно-восстановительными реакциями Сα,β ↔ Сα,β – ОН, предшествующая разрыву Сα - Сβ связи. Так как для лигнинпероксидазы не характерно восстановление карбонильной группы, полагают, что эта реакция катализируется алкогольдегидрогеназой. У гриба Phanerochaete saguinea отсутствует способность разрывать связь Сα - Сβ в субстратах с замещенным фенольным гидроксилом.
Ксилотрофы, продуцируя более широкий спектр оксигеназ, вызывают окислительную деструкцию, деметоксилирование, дегидроксилирование лигнина, расщепление ароматических колец. При рН 2,7 происходит существенное разрушение лигнинной компоненты лигноуглеводного комплекса (ЛУК) из березы грибами Kuehneromyces mutabilis 295 , Coriolus versicolor 78. Изменение рН среды и способность грибов к деструкции ЛУК свидетельствует об образовании органических кислот и ферментов, осуществляющих разрушение ароматических структур.
Полагают, что при рН 6,0-7,3 происходит разрушение углеводной компоненты ЛУК ксилотрофными грибами до простых углеводов, которые способны вовлекаться в процесс образования веществ с сопряженными двойными связями. подсолнечная лузга. При воздействии грибов на подсолнечную лузгу, которая значительно быстрее, чем другие лигнинсодержащие субстраты, разрушается ксилотрофными базидиомицетами, отмечается накопление сиреневых структур – сиреневого альдегида, сиреневой кислоты и повышение уровня карбоксильных и карбонильных групп, что свидетельствует о происходящих окислительных процессах.
Таким образом, доминирующими реакциями за счет которых происходит биодеструкция лигнина являются реакции разрыва Сa-Сb, b-0-4 и алкиларильных связей, разрыв ароматического кольца, окисление Сa и Сg атомов пропановой цепи. Скорость реакций и их направление зависит от химического строения лигнина. За счет ферментов целлюлазного и гемицеллюлазного комплексов происходит разрушение углеводного компонента растительного сырья. Наличие ферментов, обеспечивающих сопряжение метаболизма лигнина и углеводов, говорит об общей системе регулирования целлюлолитического и лигнолитического комплексов.
Современное состояние отечественных и зарубежных исследований свидетельствует о значительных успехах достигнутых в изучении ферментных систем, ответственных за различные этапы разложения растительных полимеров, особенностей механизмов их действия. Ферменты, участвующие в деградации растительной биомассы синтезируются микроорганизмами различных таксономических групп. Микроорганизмы в специализированных условиях способны продуцировать значительное количество ферментов, осуществляющих разложение растительных полимеров. Однако ни один из ныне известных продуцентов не обладает полным набором качественно и количественно сбалансированных ферментов, что ограничивает их использование в промышленных масштабах. Для решения этой проблемы в настоящее время существует несколько способов. Один из возможных путей – это поиск новых микроорганизмов, обладающих более эффективными ферментными системами, по сравнению с известными продуцентами. Основное внимание при этом уделяется местам обитания с экстремальными абиотическими факторами среды. Кроме этого, видообразование микроорганизмов – продуцентов может осуществляться в местах, подверженных длительной антропогенной нагрузке. Для повышения эффективности деградации растительной биомассы перспективно использование мультиэнзимных композиций, созданных на основе различных продуцентов. В этом случае ферменты из разных источников могут удачно дополнять друг друга, образуя высокосинергичный комплекс. Большой интерес представляют молекулярно-биологические методы, которые могут использоваться как для создания новых ферментных комплексов, так и для модификации отдельных ферментов.
Поэтому, несмотря на достигнутые успехи к важнейшим задачам по этой проблеме следует отнести выявление новых культур микроорганизмов; оптимизацию условий синтеза ферментов, участвующих в деструкции растительных полимеров; возможность применения смешанных культур; изучение свойств ферментов и субстратов, методов предферментативной обработки; условий ферментативного гидролиза субстрата и создание на этой основе конкретных экологически безопасных технологических процессов, направленных в первую очередь на превращения отходов промышленности и сельского хозяйства, в целый ряд ценных продуктов.