Методы изучения морфологии микроорганизмов
6.1. Методы микроскопии
Для изучения морфологии микроорганизмов необходим микроскоп. В микробиологии используют два вида микроскопии – электронную и световую.
А. Электронная микроскопия используется специализированными лабораториями.
1. Для ее осуществления необходим электронный микроскоп (Рис. 6-1).
Рис. 6-1. Электронный микроскоп (лаборатория Нижегородского университета, Россия)
2. Принципегодействия заключается в том, что вместо световой волны используется пучок электронов, что позволяет увеличить чувствительность метода на несколько порядков.
3. Электронная микроскопия используется для обнаружения и изучения вирусов, а также для изучения ультраструктуры бактериальной клетки.
Б. Световая микроскопия может использоваться и обычными лабораториями.
1. Обычная световая микроскопия используется в микробиологической практике сравнительно редко. В обиходе микробиологов этот метод часто называется «сухим», в противоположность иммерсионному методу микроскопии.
а. Для этого вида микроскопии используется обычный биологический микроскоп(Рис. 6-2).
б. Принцип действия этого микроскопа рассматривается в курсе физики.
в. «Сухой» объектив может использоваться, например, для микроскопирования препарата «придавленная капля» при определении подвижности бактерий.
2. При иммерсионной микроскопии используется специальное иммерсионное масло.
а. В качестве иммерсионного микроскопа служит обычный биологический микроскоп, но оснащенный специальным объективом (маркированным черной полосой).
б. Принцип метода заключается в том, что иммерсионное масло, обладая коэффициентом преломления чрезвычайно близким к коэффициенту преломления стекла, делает потерю световых лучей на границе сред стекло предметного стекла/масло и масло/стекло объектива минимальной, что улучшает качество микроскопической картины и увеличивает разрешающую способность микроскопа.
в. Именно иммерсионная микроскопия используется в бактериологии наиболее часто.
3. Более редко в бактериологии используется темнопольная микроскопия.
а. С этой целью обычный биологический микроскоп оснащается специальным темнопольным конденсором.
б. Принцип его действия заключается в том, что все прямые лучи минуют объектив, куда попадают лишь те из них, которые преломились на объекте микроскопирования. Поэтому микроорганизмы видны как светящиеся объекты на темном фоне.
в. Темнопольная микроскопия наиболее часто используется для обнаружения спирохет, так как позволяет визуализировать очень тонкие объекты.
4. В ряде случаев в бактериологических лабораториях используется фазово-контрастная микроскопия.
а. Для этого обычный биологический микроскоп оснащается специальной приставкой с особым набором линз (Рис. 6-3).
б. Принцип её действия заключается в том, что смещение фазы световой волны, происходящее при её прохождении через прозрачные для нашего глаза объекты и не воспринимаемое человеческим глазом (собственно именно поэтому такие объекты и выглядят прозрачными), преобразовывается в изменение амплитуды световой волны. А изменение этого параметра воспринимается нашим глазом – объект становится видимым.
в. Фазово-контрастная микроскопия используется, как правило, для обнаружения очень тонких (например, спирохеты, жгутики бактериальной клетки) или высоко прозрачных (например, микоплазмы) объектов.
5. И бактериологические и иммунологические и вирусологические лаборатории не могут считаться современными без возможности использования люминесцентной микроскопии.
а. Для этой цели служит особый люминесцентный микроскоп(Рис.6-4).
Рис. 6-2. Биологический микроскоп (БИОЛАМ Р-11)
| 
Рис. 6-3. Микроскоп с фазово-контрастным набором
| 
Рис. 6-4. Люминесцентный микроскоп (Олимпус ВХ 41)
|
б. Принцип её действия заключается в том, что используемые при обработке мазка для этого вида микроскопии особые, люминесцентные, красители вызывают свечение микроскопируемого объекта под воздействием коротковолнового (чаще всего – синего) света, которым он освещается (явление наведённой люминесценции).
в. Люминесцентная микроскопия широко используется в современной микробиологии.
1. Для выявления в мазке некоторых видов бактерий используются специальные флюоресцентные красители, обуславливающие специфическое свечение изучаемых микроорганизмов.
а. Для выявления возбудителя сибирской язвы используется родамин.
б. Красное свечение зёрнам волютина, наличие которых позволяет идентифицировать коринебактерии, обуславливает корефосфин.
в. Аурамин используется для выявления микобактерий туберкулёза, которые, при обработке мазка этим флюорохромом и микрокопировании его в люминесцентном микроскопе, выглядят как жёлтые палочки на зелёном фоне.
2. Люминесцентная микроскопия используется также для оценки реакции иммунофлюоресценции. Если антитела диагностической сыворотки адсорбируются на поверхности клетки, содержащий выявляемый антиген, то в люминесцентном микроскопе такая клетка будет окружена жёлто-зелёным ободком, так как антитела флюоресцирующей сыворотки метятся специальным флюорохромом – флюоресцеинизотиоционатом натрия (ФИТЦ).
6.2. Методы окраски мазков
В основном для окраски микроорганизмов используются анилиновые красители. В зависимости от их количества и, соответственно, цели исследования все методы окраски подразделяются на две группы.
А. При простых методах окраски используется лишь одна краска.
1. С этой целью в бактериологии используются, как правило, или водный фуксинили метиленовая синька.
2. Простые методы окраски используются для ориентировочной, предварительной, микроскопии – наличия в патологическом материале бактерий, определение их формы и расположения в мазке.
Б. При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале определённых микроорганизмов, а также особенностей их ультраструктуры.
1. Окраска по Граму используется для определения типа строения клеточной стенки. Это основной метод в бактериологии. В зависимости от окраски по Грамму все бактерии подразделяются на грамположительные и грамотрицательные.
2. Окраска по Цилю-Нильсену используется для выявления кислотоустойчивых бактерий (а именно – микобактерий), а также для обнаружения спор.
3. Окраска по Нейссеру используется для выявления цитоплазматических включений волютина и идентификации по их наличию коринебактерий (в частности – возбудителей дифтерии).
4. Окраска по Бури-Гинсу используется для выявления макрокапсул.
5. Окраска по Морозову используется для выявления жгутиков. Этот метод окраски используется также для выявления трепонем. Кроме того, окраску по Морозову используют в вирусологии – для выявления в оспенных пузырьках вирусов натуральной и ветряной оспы.
6. Окраска по Здрадовскому используется для выявления риккетсий и хламидий.
7. Окраска по Романовскому-Гимзе также, наряду с окраской по Здрадовскому, используется для выявления риккетсий и хламидий; кроме того, этот метод окраски используется для выявления спирохет (с их идентификацией до рода в зависимости от цвета окрашивания), а также для выявления простейших.
1Г. Тестовые вопросы по теме занятия
Микроскопический метод диагностики:
-обнаружение микроба-возбудителя в патологическом материале с помощью микроскопии
выделение микроба-возбудителя из патологического материала в чистой культуре и его идентификация
заражение патологическим материалом лабораторного животного
обнаружение специфических антител или микробных антигенов
Культуральный метод диагностики:
обнаружение микроба-возбудителя в патологическом материале с помощью микроскопии
-выделение микроба-возбудителя из патологического материала в чистой культуре и его идентификация
заражение патологическим материалом лабораторного животного
обнаружение специфических антител или микробных антигенов
Биологический метод диагностики:
обнаружение микроба-возбудителя в патологическом материале с помощью микроскопии
выделение микроба-возбудителя из патологического материала в чистой культуре и его идентификация
-заражение патологическим материалом лабораторного животного
обнаружение специфических антител или микробных антигенов
Иммунологический метод диагностики:
обнаружение микроба-возбудителя в патологическом материале с помощью микроскопии
выделение микроба-возбудителя из патологического материала в чистой культуре и его идентификация
заражение патологическим материалом лабораторного животного
-обнаружение специфических антител или микробных антигенов
Описательный период развития микробиологии:
-изобретен микроскоп и открыты микроорганизмы
разработаны методы культивирования микроорганизмов и открыты первые возбудители микробных заболеваний человека
открыт иммунитет
разработаны молекулярные методы исследования
Физиологический период развития микробиологии:
изобретен микроскоп и открыты микроорганизмы
-разработаны методы культивирования микроорганизмов и открыты первые возбудители микробных заболеваний человека
открыт иммунитет
разработаны молекулярные методы исследования
Иммунологический период развития микробиологии:
изобретен микроскоп и открыты микроорганизмы
разработаны методы культивирования микроорганизмов и открыты первые возбудители микробных заболеваний человека
-открыт иммунитет
разработаны молекулярные методы исследования
Современный период развития микробиологии:
изобретен микроскоп и открыты микроорганизмы
разработаны методы культивирования микроорганизмов и открыты первые возбудители микробных заболеваний человека
открыт иммунитет
-разработаны молекулярные методы исследования
Пастеровский период развития микробиологии:
описательный период развития микробиологии
-физиологический период развития микробиологии
иммунологический период развития микробиологии
современный период развития микробиологии
Пастером открыты:
-стафилококк
-пневмококк
-клостридии
палочка сибирской язвы
холерный вибрион
туберкулёзная палочка
Кохом открыты:
стафилококк
пневмококк
клостридии
-палочка сибирской язвы
-холерный вибрион
-туберкулёзная палочка
Пастер:
-разработал первые живые вакцины
-разработал метод стерилизации пищевых продуктов – пастеризацию
ввёл использование плотных питательных сред
первым стал использовать методы окраски мазков
оснастил микроскоп иммерсионным объективом
Кох:
разработал первые живые вакцины
разработал метод стерилизации пищевых продуктов – пастеризацию
-ввёл использование плотных питательных сред
-первым стал использовать методы окраски мазков
-оснастил микроскоп иммерсионным объективом
Учёный, с чьим именем связано становление микробиологической науки в Беларуси:
Жилибер
-Эльберт
Вотяков
Основоположник белорусской вирусологии:
Жилибер
Эльберт
-Вотяков
В один таксон объединяет объекты, имеющие общий корень происхождения:
-филогенетическая систематика
практическая систематика
В один таксон объединяет объекты, схожие по своим признакам:
филогенетическая систематика
-практическая систематика
Основная таксономическая единица в бактериологии:
вариант
штамм
клон
-вид
род
семейство
порядок
Подвидовые категории в таксономии микрооорганизмов:
-вариант
-штамм
-клон
вид
род
семейство
порядок
Основная таксономическая единица в вирусологии:
вариант
штамм
клон
вид
-род
семейство
порядок
Какой вид микроскопии наиболее часто используется в бактериологии:
электронная
обычная световая
-иммерсионная
тёмнопольная
фазово-контрастная
люминесцентная
Простые методы окраски мазков:
-метиленовым синим
-водным фуксином
по Граму
по Цилю-Нильсену
по Нейссеру
по Бурри-Гинсу
Сложные методы окраски мазков:
метиленовым синим
водным фуксином
-по Граму
-по Цилю-Нильсену
-по Нейссеру
-по Бурри-Гинсу