Постановка реакції затримки гемаглютинації (РЗГА) макрометодом

Обладнання та реактиви: антиген сухої вірус-вакцини проти хвороби Ньюкасла із штамів "Ла-Сота", екстраембріональна алантоїсна рідина від курячих ембріонів, інфікованих вакцинними штамами вірусу хвороби Ньюкасла, з гемаглютинувальним титром не менше 1 : 8; дослідні сироватки крові птиці; 1 %-ва суспензія еритроцитів півнів-донорів на фосфатно-буферному розчині (ФБР), рН 7,0, 7,2, 7,4; контрольні (еталонні) позитивні та негативні сироватки; пластини полістиролові титраційні з лунками, позначеними літерою "V"; центрифуга лабораторна на 2000 об/хв; наконечники одноразові; піпетки градуйовані на 1,0; 2,0; 5,0 і 10,0 мл або дозатори автоматичні на 50‑200 мкл, 1000 мкл; розчин фізіологічний 0,87 %-вий з рН 7,0‑7,2; вода дистильована; колби конічні скляні на 50 см3, 250 см3, 1000 см3 з лабораторними пробками; штативи лабораторні бактеріологічні для пробірок; пробірки лабораторні скляні на 5 см3, 10 см3, 15 см3, 20 см3; шафа сушильна; ваги лабораторні з похибкою зважування не більше 0,01 г; кювети лабораторні (зливні); натрію хлорид; пробірки для центрифуги; камера холодильна; розчин для дезінфекції: 3 %-вий розчин їдкого натру або інші дезінфекційні розчини; ємність зливна для відпрацьованого матеріалу; 5 %-вий розчин лимоннокислого натрію на фізіологічному розчині або розчин Альсивера (24,6 г глюкози, 9,6 г лимоннокислого натрію, дистильованої води 1200см3); термостат на 37 оС.

Підготовка антигену. Вміст ампули (флакона) сухої вірус-вакцини з штаму "Ла-Сота" (активністю не менше 8,5 lg EID 50 см3) розчиняють фізіологічним розчином у співвідношенні 1 : 5.

Приготування 1 %-вої суспензії еритроцитів півнів-донорів. Для одержання 1 %-вої суспензії еритроцитів беруть кров тільки у не вакцинованих проти хвороби Ньюкасла півнів-донорів старше 6-місячного віку, еритроцити яких не дають спонтанної аглютинації і сироватки крові періодично перевіряються на відсутність антитіл до хвороби Ньюкасла.

Кров беруть не менше ніж у трьох півнів, з підкрильцевої вени в колбу з розчином Альсивера в рівних об'ємах або у флаконі з 5 %-вим розчином лимоннокислого натрію на фізіологічному розчині (рН 7,0‑7,2) у співвідношенні 1 : 3. Одержану кров тричі відмивають фізіологічним розчином (0,1 М) або фосфатно-буферний розчин (ФБР) рН 7,0; 7,2, осаджуючи еритроцити, центрифугуючи протягом 2‑5 хв при 800 об/хв. З осаду відмитих еритроцитів готують 1 %-ву суспензію і зберігають не більше як 2 доби при темпаратурі 4 оС.

Промиті та ущільнені еритроцити зберігають у вигляді 50 %-вої суспензії на фізіологічному розчині (рН 7,2) протягом 5 діб за температури 4 оС в холодильній камері у скляній колбі з ватно-марлевою пробкою.

Одержання дослідних сироваток. Проби крові набирають в окремі пронумеровані пробірки, попередньо зволожені стерильним фізіологічним розчином. Утворений згусток обводять тонким металевим стержнем або скляною паличкою, потім пробірки вносять у термостат на 20‑30 хв при 37 оС. Далі проби крові витримують у холодильнику за 4 оС до утворення сироватки. Відстояну сироватку зливають у чисті пронумеровані пробірки і досліджують в РЗГА.

Сироватки крові інших видів птиці можуть викликати аглютинацію еритроцитів півнів. Тому в разі виявлення такої особливості проводять додаткову обробку сироваток еритроцитами. Для цього 0,025 см3 осаду еритроцитів додають до 0,5 см3 сироватки, струшують та залишають на 30 хв. Еритроцити осаджуються центрифугуванням при 800 об/хв протягом 2‑5 хв та оброблену сироватку зливають.

РЗГА ставлять у два етапи:

- титрування антигену в реакції гемаглютинації (РГА) для обчислення робочої дози вірусу;

- постановка основної реакції.

РЗГА супроводжується контролями:

- сироватки на ізоаглютинацію (сироватка + фосфатно-буферний розчин (ФБР) в рівних об'ємах + 1 %-ва суспензія еритроцитів в подвійному об'ємі). Аглютинація повинна бути відсутня;

- еритроцитів на спонтанну аглютинацію (суспензія еритроцитів + фосфатно-буферний розчин (ФБР) у рівних об'ємах). Аглютинація повинна бути відсутня.

Перший етап ‑ титрування антигену в РГА. Спочатку готують подвійні розведення антигену від 1 : 2 до 1 : 4096. Для цього в усі лунки полістиролових пластин наливають фосфатно-буферний розчин (ФБР) в об'ємі 0,25 см3. Потім у першу лунку вносять 0,25 см3 вірусу, новою піпеткою три рази піпетують і переносять 0,25 см3 суміші в другу лунку до потрібного розведення. З останньої лунки 0,25 см3 суміші видаляють у дезрозчин. У кожну лунку новою піпеткою додають по 0,25 см3 1 %-вої суспензії еритроцитів півнів.

Паралельно ставлять контроль еритроцитів на спонтанну аглютинацію, для чого в три лунки наливають по 0,25 см3 фосфатно-буферний розчин (ФБР) і новою піпеткою додають по 0,25 см3 1 %-вої суспензії еритроцитів. Полістиролові пластинки струшують обережними круговими рухами і залишають за кімнатної температури (18‑20 оС) на 30‑45 хв для осідання еритроцитів у контролі.

Результати РГА виражають хрестами, в залежності від ступеня інтенсивності реакції.

Реакція на три хрести (+ + +). По периметру лунки утворюється осад у вигляді "парасольки" з рожевими краями.

Реакція на два хрести (+ +). Пройшла менш інтенсивна аглютинація, при цьому аглютиновані еритроцити мають зубчатий вигляд.

Реакція на один хрест (+) має вигляд незначної аглютинації на дні лунки.

Негативна реакція (-) аналогічно контролю має вигляд ґудзика, який при нахилі пластини стікає.

За гемаглютинувальний титр вірусу або одну гемаглютинувальну одиницю 1 (ГАО) приймають найбільше розведення, де чітко виражена аглютинація еритроцитів у вигляді парасольки, але не менш як на 2 хрести.

Наприклад, чітко виражена гемаглютинація, одержана в розведенні 1 : 64, тобто 0,25 см3 вірусу в розведенні 1 : 64, містить одну гемаглютинувальну одиницю (1 ГАО). Для постановки РЗГА потрібно брати 4 ГАО в 0,25 см3, що становить робочу дозу вірусу, яка використовується при постановці основної реакції.

Для визначення робочої дози граничний титр вірусу ділять на 4, тобто в наведеному прикладі 4 ГАО в 0,25 см3 будуть міститися при розведенні вірусу 1 : 16 (64 : 4=16).

Для приготування робочого розведення вірусу, який містить 4 ГАО в 0,25 см3, потрібно взяти 1 см3 вихідного вірусу і додати 15 см3 ФБР. Підібрану робочу дозу вірусу необхідно використати протягом 8 год.

Перед постановкою РЗГА необхідно перевірити правильність вибраної робочої дози вірусу (4 ГАО). Для цього в 4 лунки одного ряду і 3 лунки контрольного ряду наливають по 0,25 см3 ФБР. У першу лунку з 4 наливають 0,25 см3 робочої дози вірусу. Новою піпеткою суміш тричі піпетують, а потім переносять по 0,25 см3 в наступну лунку та ін. Із останньої лунки 0,25 см3 суміші видаляють у дезрозчин. Після цього у лунки з антигеном та лунки контрольного ряду додають 0,25 см3 1 %-вого розчину еритроцитів півнів, струшують круговими рухами і залишають за кімнатної температури (18-20 оС) на 30‑45 хв.

Облік реакції проводять після осідання еритроцитів у контролі. При правильному виборі робочої дози вірусу (4 ГАО) у першій та другій лунках повинна бути повна аглютинація ("парасолька"), а в третій може бути часткова (+); у четвертій - аглютинація відсутня ("ґудзик") - негативний результат.

При одержанні інших показників з основного розведення вірусу готують нове робоче розведення (більше або менше).

Більше розведення готують за наявності аглютинації в 4-й лунці, менше - за відсутності аглютинації в 2-й лунці, тобто збільшують або зменшують концентрацію вірусу. Якщо аглютинація проявляється лише в 4-й лунці, то 1 см3 вірусу розчиняють в 24 см3 фосфатно-буферному розчині (ФБР), додаючи до вихідного розрахункового об'єму (1 : 16) ще половину, а якщо аглютинація відсутня в 2-й лунці, то 1 см3 вірусу розчиняють в 8 см3 фосфатно-буферному розчині (ФБР), тобто беруть половину первинного розрахункового об'єму. Після приготування нового робочого розведення знову ставлять контроль до отримання необхідного результату в реакції аглютинації.

Другий етап - постановка РЗГА. Для постановки реакції в 12 лунок титраційної пластини піпеткою вносять по 0,25 мл фосфатно-буферного розчину (ФБР). Потім у першу лунку новою піпеткою вносять 0,25 см3 дослідної сироватки, тричі піпетують і 0,25 см3 суміші переносять у наступну лунку та ін. до одержання граничного розведення. З останньої лунки 0,25 см3 суміші видаляють піпеткою в ємність з дезрозчином. Після цього в усі лунки новою піпеткою вносять по 0,25 см3 робочого розведення вірусу (4 ГАО). Пластини струшують круговими рухами та після 30‑45-хвної взаємодії сироватки з вірусом у кожну лунку додають по 0,5 см3 1 %-вої суспензії еритроцитів.

Реакцію ставлять за кімнатної температури (18‑20 оС) і ведуть облік результатів протягом 25‑45 хв.

За наявності в сироватці антитіл настає затримка гемаглютинації, при цьому еритроцити випадають в осад у вигляді ґудзиків з рівними краями.

Титром сироватки вважають найбільше її розведення, яке дає чітку затримку гемаглютинації (наявність "ґудзика") робочої дози антигену збудника хвороби Ньюкасла.

Достовірність результату необхідно оцінювати в порівнянні з негативним контролем, який не повинен давати титр 2.

За правильного приготування і розведення антигену еталонна сироватка має пригнічувати його гемаглютинацію до зазначеного на етикетці титру.