Другие методы определения общего белка сыворотки крови
Флюориметрические и другие современные методы определения общего белка (например, поляриграфический микрометод или атомно-абсорбционный анализ) обладают высокой чувствительностью и специфичностью, однако необходимость ввода специальной аппаратуры, а иногда и специальной квалификации аналитика наряду с достаточно высокой стоимостью определения делает этот метод достоянием научно-исследовательских учреждений и значительно ограничивает его использование в клинической лаборатории.
5) Определенные представления о пространственном строении и форме белковых молекул были получены в исследованиях с использованием электронного микроскопа. У многих белков форма молекул компактна и представляет шарообразные или вытянутые в виде эллипсоида частицы диаметром 10-30 нм. Другие белковые молекулы вытянуты в виде нитей диаметром 5-15 нм и длиной несколько сотен нм, третьи образуют палоч-ковидные структуры диаметром 10-20 нм и длиной 100-300 нм. Наиболее точные сведения о пространственном строении белков были получены методом рентгеноструктурного анализа, с помощью которого изучают структуру белковых молекул в кристаллическом состоянии. Как было выяснено, в белковых кристаллах полностью сохраняется нативная конформация молекулы, которая стабилизируется большим количеством криталлизационной воды.
Длинные нитевидные формы белковых молекул принято называть фибриллярными белками. Они содержат длинные параллельные полипептидные цепи, скрепленные поперечными связями (рис.12). Эти белки отличаются высокой механической прочностью и обычно выполняют структурную функцию. К фибриллярным белкам относятся коллаген сухожилий, миозин мышц, фиброин шелка, кератин волос и перьев.
Молекулы со сферической формой называютглобулярными белками. Их полипептидные цепи свернуты в глобулы, имеющие форму эллипсоида вращения разной степени вытянутости. К глобулярным белкам относятся ферменты, регуляторные и транспортные белки, запасные растительные белки. Они имеют компактную структуру, за счет удаления гидрофобных радикалов внутрь молекулы хорошо растворимы в воде. Например – миоглобин и гемоглобин
Между глобулярными и фибриллярными конформациями белковых молекул имеется много переходных форм, характерных для многих белков.
В связи с большими различиями формы белковых молекул и высокой степенью их полимерности существенные трудности возникают при определении молекулярных масс белков, поэтому для этих целей разра-ботаны специальные методы исследований. Для хорошо растворимых и очищенных от примесей белков молекулярные массы могут быть опреде-лены с довольно высокой точностью по изменению осмотического давления белкового раствора. Между молекулярной массой белков и величиной осмотического давления их растворов наблюдается обратная заисимость.
Для кристаллических форм хорошо очищенных белков молекулярные массы с высокой степенью точности определяют методом рент-геноструктурного анализа.
При определении молекулярных масс белков очень часто исполь-зуется метод седиментационного анализа, основанный на измерении ско-рости седиментации (осаждения) молекул белков под действием большой центробежной силы, возникающей при высокоскоростном центри-фугировании белкового раствора. Первая установка для высокоскоростного центрифугирования (ультрацентрифуга) была сконструирована Т. Сведбергом и Д.Б.Никольсом в 1923 г. В современных ультрацентрифугах можно создавать центробежное ускорение более 500000 g. Под действием центробежной силы молекулы белка, равномерно распределенные в растворе, начинают перемещаться с определенной скоростью в направлении действия центробежной силы, образуя удаляющуюся от центра вращения границу раздела между осаждающимися белками и чистым растворителем. Положение границы раздела через определённые промежутки времени регистрируется с помощью оптической системы и на основе этих результатов определяется коэффициент седиментации , который и выражает скорость седиментации белков.
По мере возрастания молекулярной массы белка коэффициент се-диментации увеличивается, однако строго прямой зависимости между этими показателями не наблюдается, так как скорость седиментации зави-сит также от формы молекул.
Значение коэффициента седиментации принято выражать в специальных единицах - сведбергах, которые обозначают символом S. Один сведберг (1S) численно равен 1×10-13 секунды. Для большинства расти-тельных белков коэффициенты седиментации находятся в пределах 1-20S.
На основе коэффициентов седиментации и диффузии белковых мо-лекул рассчитаны молекулярные массы многих белков, выделенных из различных объектов:
рибонуклеаза 12640 α-амилаза 97600
гемоглобин 64500 каталаза 247500
глиадин пшеницы 27500 эдестин конопли 300000
альбумин яйца 44000 уреаза сои 483000
зеин кукурузы 50000 пепсин 35500
Для определения молекулярных масс полипептидов, входящих в состав олигомерных белков, находит широкое применение метод электро-фореза заряженных частиц в полиакриламидном геле, который позволяет проводить очень точное разделение полипептидов под воздействием электрического поля. Под влиянием электрического поля заряженные молекулы полипептидов движутся к аноду или катоду через пористый носитель, которым является полиакриламидный гель, образующийся при совместной полиме-ризации акриламида и бисакриламида в определенной буферной среде. Этот гель сильно гидратирован и имеет поры определенных размеров в зависимости от соотношения акриламида и бисакриламида. Скорость дви-жения заряженных частиц в пористом носителе зависит от величины заряда, молекулярной массы и пространственной конфигурации молекул, поэтому в результате электрофореза разделяемые частицы, различающиеся по электрическому заряду и пространственным параметрам, распреде-ляются в полиакриламидном геле в виде узких зон, которые окрашиваются специальным красителем. Размеры окрашенных зон точно указывают концентрацию выделенных при электрофорезе полипептидов, а их общее число - наличие в изучаемой смеси разных полипептидов