МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА
Туберкулез - общее инфекционное заболевание с преимущественной локализацией процесса в легких. При туберкулезе также поражаются лимфатические узлы, серозные оболочки, пищеварительный тракт, урогенитальная система, кожа, кости и суставы (туберкулез внелегочной локализации).
Материал для исследования: мокрота, слизь с задней стенки глотки, промывные воды бронхов и желудка, моча, спинномозговая жидкость, плевральный экссудат, гной из абсцессов и др.
Больной собирает мокроту в чистую баночку или карманную плевательницу. Лучшие результаты дают исследования мокроты, выделенной больным в течение полусуток. На баночку наклеивают бумажку с фамилией и инициалами больного, заполняют специальный сопроводительный бланк (фамилия и инициалы больного, диагноз, группа диспансерного учета, цель исследования) и направляют в лабораторию.
В микробиологической диагностике туберкулеза используют бактериоскопический, бактериологический и биологический методы, а также комплекс иммунологических исследований.
Бактериоскопический метод
Туберкулезные микобактерииокрашиваются в красный цвет, все остальные элементы мокроты и другие бактерии — в синий. Туберкулезные микобактерии имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке.
При окраске по Цилю—Нильсену в красный цвет окрашиваются также кислотоустойчивые сапрофиты. Они находятся в почве, воде, молоке, масле, сметане, коже здоровых людей, желудке и т.д. При окраске по Цилю—Нильсену их трудно отличить от МБТ. Кислотоустойчивые сапрофитные бактерии окрашиваются в вишневокрасный цвет, но теряют свою окраску при длительном обесцвечивании солянокислым спиртовым раствором (от 3 ч до суток) или 0,01% раствором гипохлорита калия (КС10). Кислотоустойчивые сапрофиты в отличие от МБТ толстые, грубые, короткие, незернистые, иногда со вздутиями на концах, заостренные или веретенообразные, располагаются чаще кучками. Необходимо помнить, что аэробный микроорганизм Нокардиа (Nocardia asteroides), имеющий нежные, палочковидные, разветвляющиеся волокна диаметром 1 мкм, попадает в легкие при вдыхании воздуха и также затрудняет бактериоскопическую диагностику.
Кислотоустойчивая сапрофитная флора отличается от МБТ культуральными и биохимическими свойствами.
Положительное заключение выдают при обнаружении микобактерии туберкулеза в препарате после просмотра не менее 100 полей зрения: обязательно указывают число микробов в поле зрения. Отрицательный результат микроскопии необязательно должен свидетельствовать об отсутствии микобактерии в исследуемом материале.
Метод люминесцентной микроскопии
Препараты мокроты и промывных вод бронхов можно исследовать люминисцентным методом.
Принцип. Туберкулезные микобактерии, окрашенные ауромином-родамином, люминесцируют под влиянием ультрафиолетовых лучей в виде светящихся золотистых палочек (метод менее трудоемкий и более быстрый, чем предыдущие).
Мазки-препараты приготовляют из осадка, полученного методом накопления, фиксируют проведением через пламя. Мазки окрашивают в течение 15 мин смесью растворов флюорохромных красителей: на 1000 мл дистиллированной воды 1,0 ауромина 00 и 0,1 родамина С. После окраски мазок обесцвечивают 3% раствором соляно-кислого спирта в течение 30 сек, промывают водой. Если фон мазка сильно флюоресцирует, следует применить в качестве гасителя 0,25% водный раствор метиленового синего, промыть мазок водой, подсушить и микроскопировать в люминесцентном микроскопе. Микобактерии светятся золотисто-желтым светом на темно-зеленом фоне. Положительный ответ выдается, если в препарате обнаружено не меньше 4—5 палочек. При наличии 1—2 палочек в препарате анализ следует повторить.
Окраска ауромином-родамином, кроме того, выявляет нежизнеспособные МБТ. При окраске по Цилю—Нильсену они не выявляются, поэтому для оценки прогноза все аурамин-родамин позитивные пробы должны быть окрашены также и по Цилю—Нильсену.
Окрашивание ауромином-родамином имеет следующие преимущества перед окраской по Цилю—Нильсену:
1. кислотоустойчивые бациллы имеют большее сродство к ауромин-родаминовой окраске;
2. весь мазок может быть просмотрен при небольшом увеличении;
3. на темном фоне во флюоресцентном микроскопе МБТ выделяются более четко, и это позволяет быстрее и точнее просмотреть весь мазок.
При люминесценции кислотоустойчивые сапрофиты имеют бледно-желтый или зелено-желтый оттенок свечения, отличающийся от золотисто-оранжевого свечения МБТ.Исследуемую мокроту переносят в чашку Петри, с помощью препаровальных игл или пинцета выбирают гнойные комочки и переносят их на середину предметного стекла, накрывают комочек другим предметным стеклом и растирают материал между стеклами. Спинномозговую жидкость отстаивают в холодильнике и готовят мазки из нежной пленки фибрина. Мочу центрифугируют и делают мазки из осадка. Препараты обесцвечивают не только кислотой, но и спиртом для дифференциации от M.smegmatis, которые могут находиться в моче здоровых лиц.
Гомогенизация. Собрать в банку суточное количество мокроты и добавить равный объем 1% NaOH, закрыть стерильной резиновой пробкой и встряхивать в шюттель-аппарате до полного разжижения мокроты. Обычно для этого требуется 10-15 мин. Гомогенизированную мокроту переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3000 оборотов в минуту в течение 10-15 мин. Жидкость сливают в раствор хлорамина, осадок нейтрализуют 1-2 каплями 10% раствора НСl, из осадка приготовляют мазки, окрашивают по Цилю-Нильсену и микроскопируют.
Флотация. Мокроту переливают в колбу, прибавляют равный объем 1% раствора NaOH, закрывают резиновой пробкой и встряхивают в шюттель-аппарате до полного разжижения. Колбу помещают в водяную баню 55°С и нагревают в течение 30 мин. а затем добавляют 1-2 капли ксилола или бензина, встряхивают 10 мин, доливают дистиллированную воду до горлышка колбы и оставляют при комнатной температуре на 25-30 мин.
Углеводород всплывает на поверхность и увлекает адсорбированные микобактерии. Образуется тонкий слой углеводорода и возбудителей туберкулеза в горлышке колбы в виде сливкообразного кольца.
На хорошо нагретую водяную баню кладут обычное стекло 20х20 см и на нем раскладывают предметные стекла для мазков. Проволочной петлей в форме улитки берут материал флотационного кольца и наносят на предметные стекла, по мере подсыхания материала добавляют новую порцию взвеси. Наслоение материала по принципу толстой капли на одно и то же место делают 3-4 раза, каждую каплю подсушивают, прежде чем наносят следующую.
Готовые, хорошо высушенные препараты промывают эфиром (огнеопасно!), подсушивают, фиксируют, окрашивают и бактериоскопируют.
Исследование промывных вод бронхов или желудка выполняют после нейтрализации материала 1-2 мл 0.5% раствора NaOH.
Флотация повышает на 10% обнаружение микобактерии туберкулеза в патологическом материале.
Бактериоскопическим методом удается обнаружить возбудителя туберкулеза при содержании в 1 мл патологического материала более тысячи микобактерии.
Бактериологический метод
Все материалы для исследования бактериологическим методом, как правило, содержат постоянную микрофлору, что практически делает невозможным выделить микобактерии в чистой культуре без предварительной обработки материалов. Исключением из этого правила является стерильно взятая спинномозговая жидкость.
С целью уничтожения сопутствующей микрофлоры и гомогенизации мокроты, гноя и других материалов применяют 10% раствор серной кислоты или 10% раствор трехзамещенного фосфорнокислого натрия 1:1.
Жидкие материалы центрифугируют 30-40 мин, осадок обрабатывают серной кислотой в течение 20-30 мин, устанавливают рН среды в пределах 7,2-7,6 и высевают на среду Левенштейна - Йенсена и среду Финн-2. Засеянные среды инкубируют в термостате при температуре 37°С 3-4 недели. Пробирки со средами, в которые исследуемый материал вносили петлей и втирали в поверхность среды, размещают вертикально; в тех случаях, когда посевы делают пастеровской пипеткой, пробирки помещают в термостат в полугоризоптальном положении на 2-3 сут, а затем вертикально. Все пробки заливают расплавленным парафином или закрывают целлофановым колпачком и уплотняют резиновым кольцом.
Посевы просматривают раз в неделю. Все пробирки, в которых обнаружен рост посторонней микробной флоры, удаляют. Рост микобактерий туберкулеза обычно обнаруживается на 3-й неделе, но иногда через 2,5-3 мес.
Микобактерии туберкулеза формируют колонии на плотных питательных средах с характерными признаками. Они как правило, сухие, морщинистые, грубые (напоминают бородавки), обычно в R-форме. S-форма колоний с пигментацией желтого или оранжевого цвета при влажном росте свойственна другим микобактериям.
При учете результатов следует фиксировать обильность и сроки появления роста микобактерий. Эти показатели, определяемые в динамике, имеют эпидемиологическое и прогностическое значение.
Культуры микобактерий туберкулеза, выращенные на питательных средах, микроскопируют. В мазках, окрашенных по Цилю - Нильсену, образуются скопления кислотоустойчивых типичных микобактерий.
В молодых культурах, выделенных из организма больных, леченных антибактериальными препаратами, обнаруживают микроорганизмы с измененной формой (короткие палочки, неправильной формы шары).
В некоторых случаях исследуемый материал высевают на 3-4 пробирки жидкой питательной среды с плазмой крови донора или сывороткой крупного рогатого скота.
Результаты посева учитывают через 10 дней. Берут одну пробирку и стерилизуют, из осадка готовят мазки, фиксируют, окрашивают и микроскопируют. Отрицательный результат выдают только после инкубирования посевов в термостате в течение месяца. Посторонние микроорганизмы в таких питательных средах растут, размножаются в первые дни культивирования и вызывают помутнение жидкости.
Микобактерии, выращенные на жидкой питательной среде, пересевают в пробирки с плотной средой. В таких случаях положительные результаты возрастают, но продолжительность исследования увеличивается.
Микобактерии могут размножаться и образовывать микроколонии на стекле. Для этой цели готовят полоски обычного стекла 10 см длиной и 0,9-1 см шириной, моют, обезжиривают, сушат и стерилизуют.
Мокроту больного выливают в чашку Петри, выбирают гнойные комочки, наносят их на полоску стекла и растирают другой такой же полоской так, чтобы получились два мазка, занимающие 2/3 длины стекла. Стекла кладут на стерильную бумагу и подсушивают. Сухие мазки погружают на 15-20 мин в пробирки с 2% раствором серной кислоты, а затем 2-3 раза промывают дистиллированной водой и помещают в жидкую синтетическую или кровяную среду, в которую добавляют 10 ЕД/мл пенициллина. Мазок должен быть полностью покрыт питательной средой. Инкубируют в термостате при 37-38°С. Результаты учитываются на 1-й. 15-й и 30-й день. Каждый раз один такой мазок вынимают из пробирки, высушивают, фиксируют, окрашивают по Цилю - Нильсену или аурамином и микроскопируют. Положительными будут посевы, в которых на стекле выявляются микроскопические колонии в виде "жгутиков", "кос" и "пауков".
Определение лекарственной устойчивости
микобактерий туберкулеза
Лекарственную устойчивость микобактерий туберкулеза определяют с помощью бактериологических методов перед началом лечения, затем спустя 3 мес и далее при продолжающемся выделении бактерий туберкулеза через каждые б мес. Это делают путем выращивания микобактерий на питательных средах с различным содержанием препарата, к которому определяют устойчивость, и на тех же средах без добавления его (контроль).
Определение лекарственной устойчивости может быть: а) прямое - посев соответственно обработанного патологического материала (мокрота, гной и т.д.) на среды, содержащие лекарственные препараты; б) непрямое - пересев предварительно выделенных чистых культур микобактерий туберкулеза на среды, содержащие лекарственные препараты.
Прямой способ более эффективен, но им можно пользоваться, если микобактерии обнаруживаются в материале бактериоскопически и содержатся в значительном количестве (1-5 палочек в поле зрения). Наиболее распространенными методами определения лекарственной устойчивости являются:
1) культивирование на плотных яичных средах;
2) микрокультивирование на стеклах;
3) глубинные посевы на полусинтетические среды;.
Результаты исследования учитывают по истечении определенного срока выращивания, достаточного для получения обильного роста в контрольных пробирках.
В остальных пробирках в зависимости от концентрации препарата и степени устойчивости к нему данного штамма микобактерии туберкулеза рост может быть различной интенсивности или к этому времени отсутствовать.
Лекарственно чувствительные штаммы дают рост в пределах определенных концентраций, различных для каждого препарата.
Штаммы, которые дают рост при соответственно более высоком содержании препаратов, относят к лекарственно устойчивым. Устойчивость определяют по макроросту на плотных и по микроросту на жидких средах. Устойчивость данного штамма в целом выражается той максимальной концентрацией антибактериального препарата (количество микрограммов в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается рост, приближающийся к росту в контроле.
В части случаев выявляется обильный типичный рост микобактерии в присутствии той или другой концентрации антибактериального препарата, а на среде, содержащей более высокие концентрации этого же препарата, рост может быть скудным в виде единичных макро- или микроколоний, что указывает на размножение только некоторых, более резистентных, особей данного штамма. В таких случаях отмечают как максимальную концентрацию препарата, при которой еще размножается основная устойчивая масса микробных особей, так и предельную - при скудном росте ("относительная устойчивость" см. таб.).