ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АППАРАТ КЛЕТКИ

Учебное пособие для студентов

I курса медицинских вузов

Казань, 2010

ББК 52.5

УДК 575

Печатается по решению Центрального координационно-методического совета Казанского государственного медицинского университета

Составители:

профессор кафедры медицинской биологии и генетики

Семенов Валерий Васильевич,

ассистент кафедры медицинской биологии и генетики

Харитонов Вадим Сергеевич

Рецензенты:

заведующий кафедрой генетики Казанского государственного

университета, профессор Барабанщиков Б.И.,

заведующий кафедрой генетики Казанского государственного

педагогического университета, профессор Закиев Р.К.

Генетический аппарат клетки: Учебное пособие для студентов I курса медицинских вузов/ В.В. Семенов, В.С. Харитонов. – Казань: КГМУ, 2010. – 43 с.

Учебное пособие предназначено для студентов I курса медицинских вузов для самостоятельного изучения и получения знаний в области генетики клетки, механизмов функционирования генов, кодирования информации.

Строение гена прокариот и эукариот…………………………..……………..4

1. Введение…………………………………….………………………….…….4

2. Классификация генов………………………….…………….………………5

3. Особенности организации генов прокариот и эукариот. Строение

оперона………………………………………………………………...………..8

3.1. Строение оперона прокариот…………………….………………..8

3.2. Строение функционирующего гена эукариот……….…...……..11

Геном……………………………………………………………..……………17

1. Введение в геномику…………………………………………..…………..17

1.1. Определение генома и геномики…………………………...……17

1.2. Разделы геномики……………………………………………...…17

1.3. Этапы развития геномики………………………………….….....18

2. Организация генома человека. Явление полиморфизма……………..…20

2.1. Уникальные гены…………………………………………………21

2.2. Семейство генов…………………………………………………..21

2.3. Регуляторные зоны………………………………………….…....24

2.4. Повторы………………………………………………………...…24

2.5. Транспозоны………………………………………………………26

2.5.1. Биологическое значение транспозируемых элементов…..…27

2.6. Явление полиморфизма………………………..……………...….28

Основные свойства и функции наследственного материала.

Генетический код и его свойства………………………………………..…...31

1. Общие представления о матричном принципе передачи информации..31

2. Основные свойства и функции наследственного материала………..….32

3. Генетический код. Его свойства…………………………………….…….36

СТРОЕНИЕ ГЕНА ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ

1.Введение

Исследование структуры гена и его экспрессии в настоящее время являются одними из главных направлений в современной генетике. Но, как это часто бывает при стремительном развитии какой-либо научной отрасли, громадный поток полученных фактов не сразу осмысливается, выявленные противоречия не сразу разрешаются, а введённая терминология не сразу признаётся. Одно и то же явление подчас имеет столько различных названий, что по ним без труда можно определить число исследователей, изучавших данный феномен. Примерно такое положение складывается сейчас в направлении, которое выясняет структуру и функцию отдельного гена и генома живых существ.

Существует множество определений гена, но ни одно из них полностью не удовлетворяет всех учёных. Мы будем придерживаться определения, которое дал Сингер М. и Берг П. в книге «Гены и геномы» (1998). Формулируется оно следующим образом. «Ген – это совокупность сегментов ДНК, обуславливающих образование либо молекулы РНК, либо белкового продукта». В этом определении, прежде всего, однозначно подчёркнуто, что ген это не один непрерывный отрезок ДНК, а совокупность нескольких сегментов (отрезков) ДНК.

Производство клеточных материалов
Производство энергии и её использование
Коммуникации внутри и вне клеток
Защита клеток от инфекций и повреждений
Клеточные структуры и движение
Воспроизводство клеток

0 5 10 15 20 25 в %

Рис. 1. Примерное распределение генов человека по их функциям

Ген несёт информацию не только о строении полипептида, но и о строении какой-либо РНК. В этом случае он может не содержать информацию о строении

белка. Сейчас мы можем реально оценить функцию почти 90% генов в организме человека (см. рис.1 и рис. 2). Оказалось, что самое большое число генов необходимо для производства клеточного материала и для производства энергии в клетке. Для клеточного воспроизводства необходимо около 5% генов. Для формирования и функционирования головного мозга необходимо более 3000 генов, для работы печени и клеток крови более 2000 генов. Для создания эритроцитов необходима экспрессия 8 генов. Нормальную работу лёгких, кишечника и сердца контролирует примерно одинаковое число генов.

Кожа (около 700)

Мозг (более 3000) Глаз (более 500)

Лёгкие (около 2000) Сердце (более 1200)

Кишечник (около 1500) Печень (более 2000)

Матка (около 2000) Семенники (около 400)

Белая клетка крови Эритроцит (8)

(более 2000)

Рис. 2. Количество генов, определяющих развитие и функционирование некоторых органов и тканей человека

2.Классификация генов

Существует несколько классификаций генов. Приведём две классификации, которыми пользуется большинство учёных.

а. Одна из них постулирует наличие в клетке двух типов генов.

1. Конститутивные гены.

2. Гены «роскоши».

Гены общеклеточных функций (их ещё называют конститутивные гены или гены «домашнего хозяйства) постоянно находятся в активном состоянии. Их активность в малой степени зависти от состояния внешней среды (организма), т.е. практически не регулируется. Эти гены кодируют белки-ферменты, которые принимают участие в жизненно важных для клетки метаболических процессах. Например, таких как гликолиз, цепь передачи электронов, синтез ДНК, аминокислот и т.д. В сущности, эти гены полностью обеспечивают жизнедеятельность клетки.

Гены «роскоши» контролируют строго специализированные, специфические функции клетки. Клетка является составной частью сложного организма, а это уже более высокий уровень организации живого. На организменном уровне имеются собственные системы жизнеобеспечения, развития, размножения, дыхания и т.д. Поэтому любая клетка организма должна поддерживать не только свои жизненные потенции, которые обеспечивают гены «домашнего хозяйства», но и принимать участие в жизнедеятельности всего организма. Последним и занимаются специализированные гены. Эти гены контролируют белки, которые обеспечивают функционирование физиологических систем организма – его защитных свойств, процессов дыхания, кровоснабжения, пищеварения и т.д.

К таким генам относятся гены, контролирующие синтез гемоглобина, иммуноглобулина и др.

В отличие от генов «домашнего хозяйства» «гены роскоши» находятся под жёстким контролем организма и имеют сложный аппарат регуляции.

б. Другая классификация генов предусматривает наличие двух типов генов: структурных и регуляторных.

Оба типа генов транскрибируют различные типы РНК.

Структурные гены. Все структурные гены транскрибируют несколько видов РНК – иРНК, тРНК, рРНК и т.д. В зависимости от типа синтезируемых (или транскрибируемых) на них РНК они подразделяются на:

1. Гены, на которых синтезируется иРНК. Таких генов около 30 тысяч. Именно эти гены несут информацию о последовательности аминокислот в полипептиде. Многие из них уникальные. Однако есть гены, имеющие копии. Как правило, число копий не превышает двух.

2. Гены, с которых транскрибируется тРНК. Эти гены не несут информацию о структуре белка. Их функция заключается в синтезе достаточного количества тРНК, способных обеспечить транспорт аминокислот в рибосомы для синтеза белка. Число индивидуальных тРНК – более 60. Столько же и типов генов, кодирующих тРНК. Однако общее число генов тРНК значительно больше. Это связано с тем, что каждый ген, кодирующий тРНК, представлен не в одном экземпляре, а повторяется большое число раз.

3. Гены, с которых транскрибируется рРНК. Эти гены, так же как и предыдущие, не кодируют структуру полипептида, а синтезируют несколько разновидностей РНК (на генах эукариот синтезируется три разновидности РНК). Однако число генов, кодирующих рРНК, намного больше трёх. Как и в предыдущем случае, это связано с высокой повторяемостью каждого типа гена.

Все три типа генов объединяет одно – все они являются активными участниками синтеза белка.

В настоящее время в геноме человека насчитывается примерно 30 тысяч структурных генов. Длина всей ДНК в клетке человека примерно 1,5 метра. ДНК всех генов в ней занимает всего 3 – 10 % . Некоторые авторы сравнивают гены с островками в безбрежном океане ДНК. Некоторое представление о расположении генов на отрезке молекулы ДНК хромосомы даёт рисунок 3.

Гены

•• • •

Не информативные участки ДНК

Рис. 3. Схематичное расположение структурных генов в отрезке молекулы ДНК хромосомы

Регуляторные гены.В одну группу эти гены объединяет то, что они регулируют активность структурных генов. В настоящее время пока не имеется признанной всеми (или большинством) исследователями классификации этих генов. Наиболее простая классификация подразделяет все известные регуляторные гены на два типа:

1. Гены, с которых транскрибируются регуляторные РНК. Они не принимают непосредственного участия в синтезе белка, а регулируют отдельные стороны этого процесса (транскрипцию, процессинг и т.д.). Так, например, относительно недавно открыт новый класс регуляторных РНК, которые назвали – малые ядерные РНК (мяРНК). Эти РНК имеют небольшой молекулярный вес. Их несколько десятков, но с каждым годом открываются новые. Удивительным оказалось то, что мяРНК обладают ферментативной активностью и принимают участие в разнообразных генетических процессах, например, в процессе созревания РНК. Как ферменты они получили название – рибозимы.Таким образом, эта группа генов несёт информацию о строении рибозимов. Так выяснено, что РНК, транскрибируемая с гена Н19, влияет на злокачественное перерождение клеток. А РНК, синтезируемая на гене HFF, участвует в метаболизме железа. В последнем случае интересно то, что РНК синтезируется одновременно на обеих нитях гена (на смысловой и антисмысловой). Рибозим, синтезированный на смысловой нити, регулирует синтез мРНК, которая транскрибируется с противоположной (антисмысловой) нити.

2. Гены, которые несут информацию о структуре регуляторного белка. На них транскрибируется иРНК. Этим они похожи на структурные гены. Однако есть одно существенное отличие – на этих генах кодируется информация о регуляторном белке, который принимает участие в регуляции активности различных генетических процессов (транскрипции, трансляции, репликации, репарации и т.д.), протекающих в клетке. Эти белки способны взаимодействовать с регуляторными областями ДНК (например, с оператором) или связываться с РНК- или ДНК-полимеразой. Белки носят различные названия, например, факторы транскрипции, трансляции, терминации и др.

В отличие от этого иРНК, транскрибируемая на структурном гене, контролирует синтез белка, который является участникомклеточного метаболизма, выступая в роли фермента, строительного белка, белка-переносчика и т.д., но никак не белка-регулятора.

В настоящее время некоторые исследователи в эту же группу относят участки ДНК, на которых осаждаются регуляторные белки. Например, к таким генам они относят промотор (на нём осаждается РНК-полимераза), оператор (на нём осаждаются регуляторные белки), терминатор (в некоторых случаях на нём осаждаются белки, прекращающие синтез иРНК) и т.д. Сразу же отметим, что последний тип генов не подходит под классификацию генов Сингера М. и Берга П. (1998). И вопрос считать ли такие последовательности ДНК генами остаётся открытым. Некоторые авторы относят такие последовательности к «регуляторным зонам». Мы также будем придерживаться этого положения.

3.Особенности организации генов про- и эукариот. Строение оперона

Практически любой ген несёт информацию о строении какой-либо РНК. Эта информация закодирована в определённой последовательности триплетов. Однако сам ген функционировать практически не может. Необходим целый ряд дополнительных структур, зон или участков, которые не только включают и выключают работу гена, но и меняют интенсивность его работы в зависимости от нужд организма. К таким структурам относится множество разнообразных последовательностей ДНК, которые до настоящего времени не имеют общепризнанной классификации. Мы будем придерживаться наиболее простой (но далеко не полной) классификации. По ней дополнительные структуры подразделяются на два типа – регуляторные зоны и регуляторные гены. Регуляторные зоны – это участки ДНК, на которых не происходит синтез РНК, но которые служат местом связывания различных белков (или РНК).

На регуляторных генах транскрибируется какая-либо РНК. Эта РНК может не кодировать белок, а осаждаться на регуляторной зоне гена. Но может и нести информацию о каком-либо белке, тогда с регуляторной зоной связывается кодируемый РНК белок.

Таким образом, в настоящее время большинство учёных приходит к мнению, что наименьшей функциональной областью в ДНК является совокупность, состоящая из структурного гена, регуляторных зон и регуляторных генов.

Сам ген представляет в основном кодирующую часть ДНК. Сразу же оговоримся, что у разных генов регуляторные области различны не только по строению, величине и другим параметрам, но и отличаются по пространственному положению относительно гена (или генов), функцию которого они курируют. Понятно, что рассмотреть строение всех известных генов и их регуляторных областей со всеми индивидуальными особенностями в нашем пособии невозможно. Поэтому приведём структуру некоего гипотетического гена и его регуляторных областей, обозначив у них те участки, которые наиболее часто встречаются.

Кроме того, мы рассмотрим строение не всех структурных генов, а тех, с которых транскрибируется иРНК, несущая информацию о структуре белка. Это важно помнить, т.к. строение других генов, с которых транскрибируются тРНК, рРНК или регуляторных генов, несколько иное.

3.1.Строение оперона прокариот

Как мы отмечали раньше, для нормального функционирования гена необходимы регуляторные зоны. Регуляторных генов в этом разделе касаться не будем.

У прокариот регуляторные зоны «обслуживают» несколько генов. Эти гены вместе с регуляторными зонами носят название оперон. Таким образом, оперон состоит из двух функционально различных участков (см. рис. 4, А).

1. Кодирующий участок, который содержит несколько структурных генов.

2. Регуляторная зона, которая включает следующие участки:

а. Стартовый кодон – сайт (место) инициации транскрипции.

б. Терминатор – сайт окончания транскрипции.

в. Лидирующую область.

г. Трейлерную область.

д. Промотор.

е. Оператор.

ж. Активатор.

з. Спейсеры.

Все эти участки представлены на рисунке 4 (Б,В,Г).

Как отмечено выше, третий элемент – регуляторные гены, которые непременно входят в состав наименьшего функционирующего участка, в этом разделе не рассматриваются.

Оперон

Регуляторная зона Кодирующая область (Гены)

А 5’ 3’

Регуляторная зона Ст. 1 Ст. 2 Ст. 3

Б5’ 3’

Сайт начала транскрипции Терминатор

В5’ 3’

Лидерная последовательность Трейлерная последовательность

Ак. Пр. Оп. К о д и р у ю щ а я о б л а с т ь

Г5’ 3’

Рис. 4. Схема регуляторных и кодирующих элементов оперона прокариот. На рисунке от А до Г повышается детализация строения оперона, его регуляторной и кодирующей области. Ст.1,2,3 – структурные гены. Ак. – активатор, Пр. – промотор, Оп. – оператор

Кодирующая область (собственно ген) начинается с сайта инициации (стартовый кодон). С этого участка РНК-полимераза, проходя через структурный ген, начинает синтезировать РНК. Заканчивается кодирующая область участком, который называется терминатор(рис. 4, Б).

Подходя к нему, РНК-полимераза заканчивает транскрипцию и сходит с нити ДНК. Терминирующая область у многих генов имеет различное строение. Отметим два из них.

1. Чаще всего в терминирующей области располагается один из бессмысленных кодонов (УАА, УАГ, УГА), не кодирующий ни одну аминокислоту. Обнаружив эту последовательность, РНК-полимераза прекращает синтез РНК.

2. Сигналом к окончанию транскрипции могут быть определённые короткие последовательности ДНК (не бессмысленные кодоны), которые располагаются в зоне окончания синтеза РНК. К этим последовательностям прикрепляется белок, который и прекращает транскрипцию.

В последнее время обнаружили, что в зоне терминатора ДНК могут формировать шпильки, которые и приводят к окончанию транскрипции.

Область, располагающаяся между сайтом инициации и терминации, транскрибируется как одна нить РНК и носит название единица транскрипции. У прокариот единица транскрипции, как правило, кодирует не один, а несколько типов белков или РНК, т.е. содержит несколько структурных генов (рис. 4, Б). Все они имеют одну регуляторную область и контролируют синтез ферментов одного биохимического цикла (на рисунке они обозначены как Ст1, Ст2, Ст3).

Кроме перечисленных регуляторных зон обнаружено, что перед стартовым кодоном и терминаторомрасполагаются небольшие участки ДНК, которые соответственно носят название лидерные и трейлерные области (или последовательности). Лидерная область включает или отключает транскрипцию иРНК, трейлерная – принимает участие в «созревании» иРНК.

Особенностью лидерного участка является то, что он транскрибируется, т.е. представлен в молекуле иРНК. Но этот участок в рибосомах не транслируется, т.е. он не представлен аминокислотной последовательностью в белке. Более тщательные исследования показали, что лидерная последовательность обладает уникальной способностью приобретать форму шпильки в том случае, когда транскрипция данного гена клетке не нужна. Например, при отсутствии субстрата нет необходимости транскрибировать иРНК и транслировать с неё фермент, расщепляющий субстрат. Поэтому довольно часто отсутствие субстрата провоцирует образование в лидерной последовательности шпильки и синтез иРНК не начинается.

Трейлерная последовательностьтранскрибируется на иРНК и является сигналом для формирования полиаденинового хвостика при «созревании» про-иРНК (см. далее).

Начиная с 5’ конца, по направлению к 3’ концу располагаются – активатор, промотор и оператор (рис. 4, Г). К промотору присоединяется РНК-полимераза. Активатор и оператор регулируют активность гена. Так к активатору присоединяется белок, способный облегчить присоединение РНК-полимеразы к промотору или, наоборот, затормозить этот процесс. На операторе также осаждается белок, который может блокировать работу РНК-полимеразы.

Ещё раз подчеркнём важную особенность функционирования оперона у прокариот – одна регуляторная область оперона (куда входят активатор, промо-

тор, оператор, стартовый кодон и др.), как правило, обслуживает несколько структурных генов. Причём, между последними располагаются последовательности ДНК, не несущие никакой информации. Эти последовательности называютспейсерами (см. рис. 5).

РОСт.1 Ст.2 Ст.3 Ст.4

С п е й с е р ы Терминатор

Рис. 5. Кодирующая область оперона включает 4 структурных гена (Ст.1, Ст.2, Ст.3, Ст.4), которые разделены спейсерами. Обслуживаются они одной регуляторной областью (на рисунке она обозначена как РО)

Несколько слов о правилах обозначения генов. На рисунке 4 изображена одна нить ДНК, которая маркирована цифрами 5’(начало отрезка ДНК) и 3’(конец отрезка ДНК). Эти обозначения общеприняты и облегчают понимание процессов, происходящих в гене (транскрипции и трансляции), которые имеют выраженную направленность. Однако в обозначении направленности гена имеются некоторые особенности, без знания которых определить начало и конец отрезка ДНК сложно. Из школьного курса известно, что транскрипция РНК происходит на двухнитчатой ДНК только на одной её нити.

Эта нить ДНК называется матричной (этот термин употребляется чаще всего), антисмысловой, незначащей, не кодирующей и т.д. Понятно, что синтезированная с этой нити РНК будет комплементарна ей. Однако полное совпадение последовательностей нуклеотидов у вновь синтезированной РНК будет не с нуклеотидами матричной цепи, а с противоположной (второй, оппозитной) нитью ДНК, которая называется смысловой, не матричной, значащей, кодирующей и т.д.

Транскрипция с матричной цепочки ДНК идёт в направлении от 3’ конца к 5’. Понятно, что противоположная цепочка ДНК будет иметь направление 5’ –

3’. Это направление и принято обозначать на рисунках. Поэтому необходимо помнить, что на рисунках принято обозначать цифрами не ту цепочку ДНК, с которой синтезируется (транскрибируется) РНК, а противоположную – смысловую (см. рис. 6).

3.2. Строение функционирующего гена эукариот

В общих чертах строение гена про- и эукариот в принципе одинаково. Ген эукариот так же, как и у прокариот, функционирует только совместно с регуля-

5’ А Т А Т Г Ц А Т Г Ц 3’ Смысловая нить А ДНК 3’ Т А Т А Ц Г Т А Ц Г 5’ Антисмысло- вая нить ДНК, с которой синтези- руется иРНК Б РНК 5’ А У А У Г Ц А У Г Ц 3’ иРНК, синтезирован- ная с антисмысло- вой нити ДНК ВДНК 5’ А Т А Т Г Ц А Т Г Ц 3’ Так на рисунках обо- значается отрезок ДНК. Последователь- ность нуклеотидов в ней аналогична по- следоватнельности

их в иРНК

Рис. 6. Схема транскрипции и правила обозначения направленности ДНК. А– отрезок молекулы ДНК, Б – синтезированная иРНК на атисмысловой нити, В– цепь ДНК на рисунке обозначена так же, как и смысловая цепь ДНК

торными зонами. Но такой тандем у эукариот не называется опероном. Ген эукариот представляет собой в основном кодирующую часть ДНК, а регуляторные

зоны – не кодирующую ДНК. Так же как и у прокариот, рассмотрим не только строение самого гена – кодирующей его части, но и обслуживающие его элементы – регуляторные зоны.

1. Ген (кодирующая часть) состоит из:

а. Экзонов.

б. Интронов.

2. Регуляторные участки гена содержат:

а. Стартовый кодон – сайт (место) начала транскрипции.

б. Терминатор – сайт окончания транскрипции.

в. Лидерную последовательность.

г. Трейлерную последовательность.

д. Промотор.

е. Контролирующие зоны, располагающиеся вблизи от обслуживаемого гена.

ж. Модуляторы (энхансеры, сайленсеры) – располагаются вдали от гена.

Некоторые исследователи объединяют контролирующую зону и модуляторы в одну область – регуляторную область.

Кодирующая часть гена эукариот имеет несколько существенных отличий

от аналогичной области прокариот (рис. 7). Отметим два из них.

1. Как правило, кодирующая область представлена не несколькими генами, а одним. Каждый ген у эукариот имеет свою регуляторную область.

2. Если в генах прокариот не кодирующие участки практически отсутствуют, то ген эукариот имеет мозаичное строение – в нём чередуются участки, несущие информацию о последовательности аминокислот в белке и не несущие её. Участки, несущие информацию, носят название экзоны, не несущие называются интронами.

Мозаичное строение чаше всего встречается в генах, кодирующих белки (с этих генов транскрибируется иРНК) и тРНК. Интересно, что сходные гены у разных организмов одного вида часто имеют одинаковое число интронов в одних и тех же позициях. Обычно длина интронов превышает длину экзонов.

Кодирующая часть гена представляет единицу транскрипции.

5’ э и э и э и э 3’

ТП

ЛП

Терминатор

Сайт начала транскрипции

Рис. 7. Схема кодирующей области гена эукариот (э – экзоны, и – интроны, ЛП-лидерная последовательность, ТП – трейлерная последовательность)

Рядом располагающиеся контролирующие зоны

Лидерная последовательность

Промотор Кодирующая область

Модуляторы Сайт инициации

Контролирующие области

Рис. 8. Схема возможного расположения кодирующей части гена и промотора

Что касается регуляции, то необходимо пояснить, что существуют два термина – регуляторные области (зоны, участки и т.д.) и регуляторные гены (гены-регуляторы).

Регуляторные области – это участки ДНК, на которых осаждаются белки-регуляторы. Их функция – регуляция транскрипции. Для простоты эти зоны подразделяют на два типа. Мы их отметили выше, но всё же повторим.

а. Зоны, располагающиеся близко от гена, который они контролируют – контролирующие зоны.

б. Зоны, располагающиеся далеко от контролируемого гена – модуляторы (рис.8).

Гены-регуляторы – это обычные структурные гены, кодирующие иРНК, несущую информацию о строении какого-либо белка-регулятора. Некоторые из этих генов транскрибируют специальные регуляторные РНК.

Рассмотрим строение регуляторных областей. Их несколько. На 5’- конце гена располагается сайт начала транскрипции. На 3’-конце располагается сайт окончания транскрипции (терминатор). Перед сайтом начала транскрипции так же, как и у прокариот, располагается лидерная последовательность, а перед сайтом окончания транскрипции находится трейлерная последовательность. Функциональное значение этих участков аналогично таким же участкам у прокариот (см. выше). Если у прокариот транскрипцию всех генов осуществляет один фермент РНК-полимераза, то у эукариот существует три типа РНК- полимераз, которые обеспечивают транскрипцию разных эукариотических генов (генов, кодирующих иРНК, тРНК и рРНК). У большинства генов эукариот, как и у прокариот, эти ферменты связываются с участком, расположенным на 5’-конце ДНК перед сайтом инициации. Этот участок носит название промотор. Однако в отличие от прокариот, у эукариот одна РНК-полимераза соединиться с промотором не способна. Прежде чем связаться с промотором РНК-полимераза эукариот соединяется с многочисленными белками (их около 50), которые способствуют её прикреплению к промотору. Эти белки называются факторами транскрипции, а образовавшийся комплекс РНК-полимеразы с факторами транскрип- ции именуется комплексом транскрипции (или транскрипционным комплексом). Факторы транскрипции (их так же можно назвать регуляторными белками) активируют РНК-полимеразу и кодируются регуляторными генами. Образование комплекса транскрипции и его активность, в свою очередь, контролируют ещё два типа белков-регуляторов. Первый тип белков осаждается на регуляторные (зоны) последовательности ДНК, которые располагаются, как правило, рядом с промотором. Эти белки ускоряют или тормозят образование транскрипционного комплекса. Регуляторные последовательности имеют различные названия. Чаще всего их объединяют термином – контролирующие зоны или цис-регуляторные элементы. К этой зоне относится лидерная последовательность, промотор и регуляторные зоны, располагающиеся рядом с промотором – рядом расположенные области (рис. 9).К контролирующим зонам присоединяются различные регуляторные белки, которые влияют на начальное связывание РНК-полимеразы с промотором. Эти белки носят специальное название – факторы транскрипции.

Второй тип регуляторных последовательностей усиливает или тормозит движение транскрипционного комплекса по гену. У эукариот эти участки часто

расположены далеко от контролируемого ими гена: впереди от 5’-конца кодирующей области, в самой кодирующей области или позади неё. В некоторых случаях их выявляют на других хромосомах (рис.9. А,Б,В,Г). Как правило, на этих областях, так же как и на контролирующих зонах, осаждаются регуляторные белки, усиливающие или замедляющие транскрипцию. Эти регуляторные последовательности настолько разнообразны по строению, положению и функциям, что для большинства из них пока не найдено название. В последнее время некоторые учёные называют их модуляторами или транс-регуляторными элементами(респонсивные элементы)(рис. 8). К модуляторам относятся энхансеры(усиливают транскрипцию с некоторых эукариотических промоторов) и сайленсеры (обладают противоположным действием по отношению к энхансерам), оказывающие дистанционное влияние на инициацию транскрипции независимо от своей ориентации относительно кодирующей области. Предполагается, что их регулирующий эффект связан со сближением модуляторов с транскрипционным комплексом в результате изгиба молекулы ДНК (рис. 10.).

Р Кодирующая область

Р К

К Р К.

К Р

Р К

Рис. 9. Схема возможного расположения кодирующих (К) и регуляторных (Р) областей в генах эукариот. А – регуляторная зона располагается впереди кодирующей области, Б- между регуляторной и кодирующей областью располагаются нуклеотидные последовательности, не связанные с деятельностью гена, В – регуляторные области располагаются внутри кодирующей, Г – регуляторные области располагаются за кодирующей областью, Д – регуляторные и кодирующие области располагаются на разных хромосомах

Резюме. Ген это – совокупность сегментов ДНК, контролирующих образование либо молекулы РНК, либо белкового продукта. Гены бывают структурными и регуляторными. К структурным генам относятся гены, кодирующие иРНК, рРНК и тРНК. К регуляторным относятся гены, участвующие в регуляции экспрессии генов. Оперон прокариот состоит из структурных генов (одного или нескольких) и регуляторной области. Последняя, в свою очередь, состоит из активатора, промотора, оператора и терминатора. Активатор активирует присоединение РНК-полимеразы к промотору, на оператор осаждается белок-регулятор, блокируя движение РНК-полимеразы через оператор.

Факторы транскрипции

РНК-полимераза

ДНК, промотор

Белки-регуляторы

Промотор

Контролирующая зона

Энхансер

Сайленсер

Белки-регуляторы

Рис. 10. Распределение регулирующих зон относительно друг друга:

1.Белки, соединяющиеся с РНК-полимеразой.

2.Белки, соединяющиеся с ДНК контролирующей зоны.

3.Белки, соединяющиеся с ДНК модуляторов

Терминатор – область, где заканчивается транскрипция РНК. Состоит из бессмысленных кодонов. В отличие от прокариот каждый ген эукариот имеет отдельную регуляторную область. Кодирующая область эукариот состоит из экзонов (информативные участки) и интронов (неинформатив-

ные участки). Регуляторная область у эукариот устроена значительно сложнее. Есть область (промотор), где осаждается сложный транскрипционный комплекс, куда входит РНК-полимераза. Формирование этого комплекса контролируется специальными участками, расположенными вблизи гена – контролирующие области. Другие регуляторные зоны могут находиться рядом с геном или вдали от него и называются модуляторами. Они регулируют движение РНК-полимеразы по гену.

ГЕНОМ

1. Введение в геномику

Определение генома и геномики

Прежде всего, определим понятие «геном». Существует несколько определений генома. В энциклопедическом словаре «Генетика» Н.А.Картель и др. даётся два определения генома. Во-первых, под геномом понимают совокупность гаплоидного набора хромосом данного вида организмов. И, во-вторых, – это весь генетический материал отдельного вируса, клетки или организма, не являющегося аллоплоидным. В нашем изложении мы будем исходить из того, что геном клетки – это вся совокупность ДНК, находящаяся в ядре и митохондриях (пластидах) этой клетки или организма. Такое определение часто используется в работах, связанных с изучением генома.

Строение и функцию генома изучает специальная наука – геномика.

Успехи в изучении генома человека стали наиболее ощутимы в связи с разработкой и последующим выполнением международного проекта «Геном человека». Этот международный проект объединил усилия сотен учёных из разных стран и осуществлялся с 1989 г. по 2000 г. Главные направления проекта – картирование генов (определение локализации генов в хромосомах) и секвенирование ДНК или РНК (порядок расположения в ДНК или РНК нуклеотидов). Инициатором этого движения с самого начала стал лауреат Нобелевской премии учёный Дж. Уотсон. В России таким энтузиастом стал академик А.А. Баев. На проект было затрачено свыше 6 млрд долларов. Материальные затраты России были настолько скромны, что их не учитывают при общем подсчёте издержек. Несмотря на это, российские учёные проводили исследования по картированию 3, 4, 13 и 19 хромосомам. Проект позволил полностью расшифровать последовательность нуклеотидов в геноме человека. Фактически это был первый этап – структурный. Второй этап, который назвали функциональным, будет связан с расшифровкой функции гена. Полученные результаты в области исследования генома легли в основу выпущенного в США Ч. Кэнтором и К. Смит в 2000 г. первого учебника для вузов «Геномика».

Разделы геномики

Геномика подразделяется на пять самостоятельных разделов.

Структурная геномика изучает последовательность нуклеотидов в геноме, определяет границы и строение генов, межгенных участков, промоторов,

энхансеров и др., т.е. фактически принимает участие в составлении генетической карты организма. Подсчитано, что геном человека состоит из 3,2 млрд нуклеотидов.

Функциональная геномика идентифицирует функцию каждого гена и участка генома, их взаимодействие в клеточной системе. Одна из важнейших задач геномики – создать, так называемую «генную сеть», взаимосвязанную работу генов. Например, генная сеть системы кроветворения включает в себя работу не менее 500 генов. Они не только взаимосвязаны между собой, но связаны и с другими генами.

Сравнительная геномика изучает сходства и различия в организации геномов разных организмов.

Эволюционная геномика объясняет пути эволюции геномов, происхождение генетического полиморфизма и биоразнообразия, роль горизонтального переноса генов. В применении к человеку, также как и к любому организму, можно сказать, что эволюция человека – это эволюция генома.

Медицинская геномика решает прикладные вопросы клинической и профилактической медицины на основе знания геномов человека и патогенных организмов.

Геномика человека является основой молекулярной медицины и её достижения используются при разработке эффективных методов диагностики, лечения и профилактики наследственных и ненаследственных заболеваний. Если раньше предполагали, что наследственная патология связана с определёнными генами или регуляторными зонами, то сейчас всё большее внимание привлекают нуклеотидные последовательности, располагающиеся в межгенных промежутках. Они долгое время считались «молчащими». В настоящее время накапливается всё больше сведений об их влиянии на экспрессию генов.

Исследования в области генома ещё раз подтвердили необходимость индивидуального подхода к профилактике и лечению заболеваний. Значительный интерес представляют для медицины исследования, связанные с составлением «генной сети» – схем взаимодействия генов между собой на уровне белковых продуктов. Эти исследования способствовали созданию в рамках геномики новой науки – протеомики, которая изучает белковый пейзаж клетки в различных режимах функционирования генов. Полученные результаты однозначно показывают целесообразность индивидуального подхода к лечению заболеваний. Сейчас протеомика – самостоятельная наука, тесно связанная с геномикой.

В этой связи следует подчеркнуть, что тезис «лечить не болезнь, а больного» получил существенное подтверждение в многочисленных исследованиях генома и белков. Основываясь на них, приоритетность этого положения в медицинской практике перестала вызывать сомнения.

Этапы развития геномики

Хотя геномика как наука появилась сравнительно недавно в её становлении уже можно различить несколько этапов.

1 этап. 1900 – 1940 гг. На этом этапе изучались менделирующие признаки человека. Метод исследования – генеалогический анализ. Систематическое изучение генома человека фактически началось с развития менделевского анализа наследственных признаков у животных в начале 20 века. В применении к человеку это был генеалогический метод исследования наследственных признаков. На этом этапе учёные в основном выявили менделирующие признаки человека и вплотную подошли к описанию групп сцепления. Обнаружено около 400 менделирующих признаков человека и 4 группы сцепления. Начиная с 50-х годов прошлого века, процесс открытия групп сцепления и менделирующих признаков замедляется. В настоящее время генеалогический метод изучения генома человека в чистом виде себя исчерпал.

2 этап. 1940 – 1980 гг. Этап изучения групп сцепления. Методы изучения – генеалогический, цитогенетический и метод гибридизации соматических клеток. Существенный прогресс цитогенетики человека, особенно генетики соматических клеток в 60-х годах в комплексе с генеалогическим подходом поставил изучение генома человека на новые теоретические основы. Внедрение в практику научных исследований биохимических и иммунологических методов существенно ускорило не только открытие новых менделирующих признаков, но и облегчило процесс расшифровки в геноме человека новых групп сцепления генов. К сожалению, знание групп сцепления всё же не позволяет определить точную локализацию генов в хромосомах, а последнее необходимо для успешного развития генетической инженерии и связанных с ней практических проблем в области медицины, сельского хозяйства и т.д. Поэтому начинает резко увеличиваться число исследований в области составления карт (картирования) генов.

3 этап. 1980 г. по сегодняшний день. Этап изучения локализации генов в геноме и расшифровка их нуклеотидной последовательности. Методы изучения– биохимические, иммунологические. Этот этап начал формироваться в 1980-х годах с развитием молекулярно-генетических методов и технологии генной инженерии. Процесс познания генома углубился до выделения гена в чистом виде и его секвенирования (установления нуклеотидной последовательности).

В США и Великобритании были разработаны и внедрены автоматические приборы по секвенированию геномов. Их назвали геномотронами.В них осуществляется более 100 000 полимеразных реакций в час. Большую роль на этом этапе играют вычислительная техника и информационные системы. Благодаря им решаются вопросы накопления информации из разных источников, хранения её и оперативное использование исследователями разных стран.

К 1980 г. был полностью картирован геном одной из бактерий, в 1986 г. закончено картирование ДНК дрожжевой клетки, в 1998 г. полностью картирован геном круглого червя и т.д. К настоящему времени полностью завершено определение последовательности оснований в ДНК более чем 50 представителей животного мира (в основном с малым размером генома – возбудители пневмонии, сифилиса, риккетсии, спирохеты, дрожжи, круглый червь и т.д.). Завершается аналогичная работа и в отношении генома человека. Описано более 19 тысяч заболеваний человека, из них около 3 тысяч – наследственные болезни.

Одна из интересных инициатив в области геномики заключается в создании искусственной ДНК, которая содержала бы минимальный набор генов, необходимых клетке для автономного существования. Подсчитано, что для этого потребуется около 350 – 450 генов.

В настоящее время вся нуклеотидная последовательность генома человека расшифрована, решается следующая задача – изучение однонуклеотидных вариаций ДНК в разных органах и клетках отдельных индивидуумов и выявление генетических различий между индивидуумами. Это позволит перейти к созданию генных портретов (карт) людей. Это, с одной стороны, поможет успешнее лечить заболевания, с другой, ставит ряд серьёзных вопросов. Например, страховые компании могут использовать сведения из генетической карты подающего на страховку человека, несущего рецессивный ген болезни, для взвинчивания цен при его страховании.

С другой стороны, предполагается, что на следующем этапе развития геномики значительное место займут исследования, связанные с расшифровкой функциональных характеристик всех кодирующих и не кодирующих областей генома в приложении к индивидууму.

Индивидуальный подход к изучению структуры и функции генома людей, скорее всего окажется ведущим в развитии этой области генетики.

Международный проект «Геном человека», в котором участвовало несколько тысяч учёных, закончил функционировать в 2000 г. Однако исследования в этом направлении не прекращаются. Это был один из самых дорогостоящих проектов в истории цивилизации, его стоимость более 500 миллионов долларов в год.

К сожалению, Россия приостановила свой вклад в международный проект «Геном человека».

2.Организация генома человека. Явление полиморфизма

Если выделить молекулу ДНК из всех хромосом одной клетки человека (гаплоидного набора) и соединить их в единую нить, то длина её будет примерно 1,5 метра. Но не следует думать, что геном человека наибольший из всех существующих в природе. У саламандры и лилии длина молекул ДНК, содержащихся в одной клетке, в тридцать раз больше, чем у человека. В полутораметровой молекуле ДНК человека предполагается наличие около 30 тысяч генов. Это только те гены человека, которые несут информацию о структуре белка. С этих генов транскрибируется иРНК. По подсчётам учёных эти гены занимают в геноме примерно 1%. Все виды РНК (иРНК, тРНК, рРНК, мяРНК и другие) синтезируются примерно с 25 – 26% всей ДНК клетки. Из этого следует, что основную массу ДНК в геноме человека составляет неинформативная, молчащая ДНК. Причём гены в геноме располагаются не последовательно друг за другом, а участками, которые отделены друг от друга некодирующими последовательностями.

Деление всего генома на участки, несущие информацию о строении белка и не несущие, было характерно для первых этапов развития представлений о гено-

ме. В настоящее время классификация сегментов, составляющих геном клетки, значительно усложнилась. Рассмотрим самый простой вариант классификации.

Геном клетки человека состоит из следующих участков:

1. Уникальных генов.

2. Семейств генов.

3. Регуляторных зон.

4. Повторяющихся участков ДНК, которые несут какую-либо функцию, т.е. участвуют в каких-либо генетических процессах (транскрипции, трансляции, репликации, репарации, процессинге и т.д.).

5. Повторяющихся участков ДНК, у которых в настоящее время достоверно не выявлено какой-либо функции. Однако предполагают, что эти участки могут участвовать в процессах упаковки ДНК.

6. Транспозонов.

Всё вышесказанное относится к структуре генома отдельно взятого индивидуума. Если сравнить геномы двух и более индивидуумов, то окажется, что в основном они одинаковы. Однако будут выявлены локальные изменения в нуклеотидных последовательностях их ДНК. Эти различия небольшие, но именно они определяют индивидуальные фенотипы людей. Это явление носит название полиморфизм.

2.1. Уникальные гены

Это гены, представленные в геноме в одном экземпляре. К таким генам относятся некоторые структурные и регуляторные гены. Однако большинство структурных и регуляторных генов представлено в геноме не в единственном экземпляре, а в виде двух, трёх и большего числа копий. Возможно, это имеет какой-то биологический смысл в плане противостояния повреждающим факторам – при повреждении одного гена, функцию берёт на себя его дублёр. Все другие типы генов (кодирующие различные РНК) не являются уникальными.

2.2. Семейство генов

Тщательные исследования нуклеотидных последовательностей в геноме позволили выявить участки ДНК, которые по своей нуклеотидной последовательности удивительно схожи (копии) с некоторыми структурными и регуляторными генами, которые раньше считали уникальными. Дальнейшие исследования показали, что в геноме человека имеется генетический процесс, который тиражирует гены. Этот процесс хорошо описан и носит название дупликация (удвоение). Не касаясь механизмов дупликации, отметим, что итогом этого процесса является удвоение какого-либо участка ДНК, соответственно и гена (или нескольких генов), который содержится в этом участке. В результате дупликации в геноме наряду с уникальным геном появляется его копия.

Если учесть, что эволюция человека длилась несколько тысячелетий, то понятно, что за этот большой отрезок времени в результате дупликации гена-пред-

ка сформировалась не одна, а несколько его копий. Эти копии, если в них не происходили мутации, могли функционировать как основной ген. Если же в структуре копии происходило повреждение (мутация), которое в последующем не восстанавливалось, то экспрессия такой копии прекращалась, а в геноме появлялся не функционирующий псевдоген (неактивный, молчащий ген).Могло произойти и другое, когда ген, имеющий повреждение, продолжал функционировать, и на рибосомах синтезировался белок, отличающийся от первоначального. Если функция этого белка была совместима с жизнью, такой организм размножался и мутантный генпереходил его потомкам, сохраняясь в семействе генов. Варианты появления различных генов в результате двух процессов – дупликации и мутаций показаны на рисунке 11.

В последнее время обнаружен ещё один процесс, который связан с образованием копий. Он происходит во время сплайсинга, когда на сформировавшейся РНК синтезируется её ДНК-копия. Последняя, затем, встраивается в геном.

Набор генов, возникший от некоего гена-предка путем дупликации и последующих изменений, называется семейством генов. На рисунке 11 к семействугенов относятся Ст1, Ст1а, Ст1б, Ст1в.

В семейство могут входить три типа генов:

· функционирующий ген или его копии,

· нефункционирующие копии – псевдогены,

· функционирующие мутантные гены и т.д.

Как правило, у псевдогена всегда можно обнаружить мутацию, которая прекратила его функцию.

В последнее время вопрос о функционировании некоторых мутантных генов стал интересовать врачей-иммунологов. Имея нуклеотидную последовательность, отличающуюся (в результате мутации) от структуры нормального гена, такой ген будет транскрибироваться, а затем транслироваться в дефектный белок с изменённой структурой. Известно, что такие белки могут выступать в организме в качестве чужеродных и провоцировать появление различного рода аллергических реакций.

Семейства генов могут повторяться в геноме несколько раз, располагаясь на одной хромосоме, рядом друг за другом (тандемно) или отделённые друг от друга тысячами пар нуклеотидов (рис. 12). В некоторых случаях они могут быть разбросаны по разным хромосомам. В любом случае наличие дублеров в семействе генов обеспечивает большую устойчивость генома к повреждениям.

Объединение в семейства характерно для многих генов человека – кодирующих глобин, гистоны, интерфероны, актин и тубулин, тРНК, рРНК и др.

Приведём примеры. a- и b-цепи белка глобина (белковая часть молекулы гемоглобина человека) кодируются двумя генами a и b. У взрослого человека глобиновые гены представлены двумя семействами — a и b. a- семейство включает в себя два гена a и один псевдоген a..b- семейство состоит из одного гена b и одного псевдогена. Кроме того, в каждый кластер входят родственные гены, кодирующие глобин на разных этапах эмбриогенеза. Получается достаточно громоздкая конструкция.

Дупликация + мутация

ДНК

Ст1 Ст1а Ст1б Ст1в Ст1г

Ген-предок Копия Псевдоген Копия гена с Новый

изменённой ген

функцией

Рис. 11. Схема формирования копий структурного гена Ст1 в результате мутаций и дупликаций на одной молекуле ДНК. Ст1а – мутация не изменила функцию гена; Ст1б – мутация привела к выключению гена, ген не активен; Ст1в – мутация изменила количественные характеристики контролируемого продукта гена, уменьшилась или усилилась активность гена; СТ1г – мутация изменила качественную характеристику продукта, сформировался новый ген

Промежуточные последовательности ДНК

Семейство генов Это же семейство на этой же хромосоме

Рис. 12. Расположение двух семейств одного и того же гена на хромосоме

Наличие в a- кластере двух идентичных генов, кодирующих a-цепь глобина, а в b-кластере только одного активного гена, позволяет предположить большую повреждаемость b-цепи. И, действительно, из описанных 100 нестабильных гемоглобинов в большинстве случаев мутация затрагивает b-цепь. Другими, чрезвычайно важными для клетки белками, являются гистоны. Взаимодействуя с молекулой ДНК, они формируют надмолекулярные структуры — нуклеосомы. Гистоны представлены пятью различными белками — Н1, Н2А, Н2В, Н3 и Н4 и наделены самыми разнообразными функциями — участие в конденсации хромосом, экспрессии генов, репликации и т.д. Но есть в их деятельности одна особенность, которая привела к созданию особой с