Концентрирование, выделение и сушка продуктов
Микробного синтеза
Культуральная жидкость представляет собой сложную смесь, содержащую микробные клетки, продукты метаболизма, остатки компонентов питательной среды, пеногаситель.
Технология получения продуктов микробного синтеза из культуральной жидкости зависит от происхождения и товарной формы биопрепарата. Различают следующие группы препаратов: на основе инактивированной биомассы клеток (кормовые препараты белков, аминокислот, антибиотиков и т. д.), на основе очищенных продуктов метаболизма микроорганизмов (ферменты, антибиотики, витамины, органические кислоты и др.), препараты в виде жизнеспособных микроорганизмов (бактериальные удобрения, средства защиты растений, закваски и др.). Товарными формами биопрепаратов являются жидкие концентраты (45–50% сухого вещества), пасты (20–40% влаги), кристаллические вещества (1,5–5,0% свободной влаги), сухие порошкообразные и гранулированные продукты (8–11% влаги). Себестоимость жидких концентратов и паст значительно ниже, чем сухих продуктов.
Целевым продуктом биосинтеза может быть непосредственно микробная масса либо продукты метаболизма микроорганизмов, растворенные в межклеточной жидкости или находящиеся внутри клеток. Иногда целевые метаболиты могут находиться одновременно и внутри клеток, и в межклеточной жидкости.
Низкая концентрация биомассы и метаболитов в культуральной жидкости обусловливает необходимость проведения ряда последовательных операций по концентрированию и очистке целевого компонента. Количество операций возрастает с повышением требований к чистоте продукта. Общая схема переработки культуральной жидкости представлена на рис. 44.
Рис. 44. Общая схема переработки культуральной жидкости:
1 – производство кормовой биомассы; 2 – целевой продукт – экзометаболит;
3, 4 – целевой продукт – эндометаболит
В большинстве производств переработка культуральной жидкости начинается с отделения микробной массы. Для этого применяют осаждение в поле центробежных сил (сепарацию, центрифугирование); фильтрование; флотацию; обработку культуральной жидкости коагулянтами (FeCl3, Al2(SO4)3), флокулянтами полисахаридной природы или синтетического происхождения (высокомолекулярными полиэлектролитами), гельобразующими агентами (суспензия Ca(OH)2 + H3PO4) с последующим отделением осадка фильтрованием.
По современным представлениям поверхность клеток микроорганизмов имеет мозаичную структуру, сформированную из катионных и анионных групп. На одну клетку приходится 106–107 положительных и 107–108 отрицательных зарядов, т. е. клетки большинства микроорганизмов имеют избыточный отрицательный заряд. Высокие значения плотности поверхностного заряда клеток приводят к их электростатическому отталкиванию, что является одной из причин агрегативной устойчивости микробных суспензий, которые можно рассматривать как биоколлоидные системы. Кроме того, клетки микроорганизмов являются типичными лиофильными объектами, для которых характерно взаимодействие с дисперсионной средой, приводящее к образованию сольватных оболочек, что также обусловливает агрегативную устойчивость биоколлоидов.
Обработка микробной суспензии коагулянтами, флокулянтами, гельобразующими агентами позволяет не только дестабилизировать биоколлоидную систему и осадить клетки, но и очистить содержащую целевой метаболит межклеточную жидкость от балластных примесей (белков, красящих веществ и др.).
Фильтруемость культуральной жидкости зависит от ряда факторов: вида микроорганизма-продуцента (размера и структуры клеточных образований), состава питательной среды и степени потребления компонентов, длительности ферментации. Присутствие в значительном количестве неассимилированных питательных веществ, жиров, применяемых в качестве пеногасителя, а также лизис клеток в результате продолжительного культивирования негативно влияет на скорость фильтрования.
Мицелий грибов, имеющий нити диаметром 10–40 мкм, отделяется от жидкой фазы фильтрованием без особых затруднений. Тонкие (0,2–1,0 мкм) нити мицелия актиномицетов забивают поры фильтрующего материала и образуют осадок с высоким гидравлическим сопротивлением. Поэтому культуральные жидкости после выращивания актиномицетов, бактерий подвергают специальной обработке. Наиболее распространенные приемы улучшения фильтруемости – тепловая коагуляция при 70–75°С (вызывает денатурацию и коагуляцию белков, что снижает сопротивление осадка), обработка полиэлектролитами, добавление реагентов, образующих малорастворимые осадки (Ca(OH)2 + H3PO4), предварительное нанесение на фильтрующий материал намывного слоя толщиной 5–50 мм из перлита или древесной муки.
Чаще других применяются барабанные вакуум-фильтры и фильтр-пресс ФПАКМ. Важнейшим достоинством фильтра-пресса является низкая влажность получаемого осадка (около 60%).
Широкое распространение получил сепарационный метод концентрирования микробных (прежде всего дрожжевых), которые позволяют с высокой скоростью обрабатывать большие объемы труднофильтруемой культуральной жидкости.
Заслуживает внимания флотационный способ сгущения дрожжевой суспензии, при котором концентрирование дрожжей достигается за счет перехода клеток в пену в результате продувки суспензии мелкодиспергированным воздухом. Флотационный способ концентрирования дрожжей имеет ряд преимуществ перед сепарационным: простота и доступность оборудования, низкие энергозатраты на процесс, повышение качества продукта за счет отделения нефлотирующихся примесей. Однако не все дрожжевые культуры обладают достаточной флотационной способностью, которая зависит от физиологических особенностей штамма и химического состава культуральной жидкости. В связи с этим флотация находит ограниченное применение, например, для концентрирования дрожжей Candida scottii (продуцентов белка), выращенных на гидролизном сусле.
При производстве биопрепаратов на основе инактивированной биомассы клеток широко используют упаривание культуральной жидкости в трех-, четырехкорпусных выпарных установках до содержания сухих веществ в концентрате 20–45%. Целевые продукты микробного синтеза термолабильны, поэтому упаривание осуществляют под разрежением и при режимах, обеспечивающих минимальные потери биологической активности продуктов. Как правило, температура кипения жидкости в первом корпусе выпарной установки составляет 80–85°С, в последнем – 50–55°С. Наибольшее распространение получили трехкорпусные выпарные установки со стекающей пленкой, которые отличаются компактностью, высокой производительностью по испаряемой влаге и небольшим временем пребывания упариваемой жидкости в аппарате.
При необходимости сгущения концентрата до высокого содержания сухих веществ (60–65%) применяют роторные испарители.
Целевыми продуктами микробного синтеза могут быть внутриклеточные биополимеры (нуклеиновые кислоты, белки, липиды), а также эндометаболиты (антибиотики, витамины, ферменты). Некоторые компоненты можно извлечь без предварительного разрушения клеточной стенки (например, экстракцией), в других случаях (для выделения внутриклеточных биополимеров) требуется дезинтеграция клеточной массы, которую осуществляют различными методами. При химической дезинтеграции клеточную суспензию обрабатывают агентами (щелочью, глицерином, толуолом, пероксидом водорода), которые повышают проницаемость клеточных стенок. Биологические способы разрушения оболочки основаны на действии собственных гидролитических ферментов (автолиз) или специальных ферментных препаратов (лизоцим, зимолиаза и др.). Наибольшее промышленное значение имеют физические методы, которые более экономичны, чем химические и ферментативные. Чаще всего применяют обработку клеточной массы ультразвуком. Могут быть использованы такие приемы, как растирание с кварцевым песком, замораживание – оттаивание, продавливание массы через узкие отверстия под высоким давлением, декомпрессия (сжатие клеточной суспензии с последующим резким снижением давления). Фрагменты клеточных стенок отделяют центрифугированием или фильтрованием.
Выделение целевых компонентов из сложной смеси дезинтегратов клеток – трудоемкий и дорогостоящий процесс, который целесообразен в производстве только очень ценных биологически активных веществ. В биотехнологии предпочтение отдают использованию штаммов микроорганизмов, экскретирующих целевой компонент. В этом случае технология получения чистых препаратов существенно упрощается.
Распространенными промышленными методами выделения экзометаболитов из культуральной жидкости являются: ионный обмен с использованием сухих и жидких ионообменных смол – катионитов и анионитов (производство аминокислот); экстракция органическими растворителями (производство антибиотиков); осаждение из растворов солями и органическими растворителями (ферментные препараты); кристаллизация (витамины, антибиотики, аминокислоты). Выделить целевой продукт с высокой степенью чистоты одним методом практически невозможно. В производственных условиях применяют комбинации различных методов.
В последние десятилетия сформировалось новое и исключительно перспективное для биотехнологии направление – мембранные методы разделения сложных смесей, главная отличительная особенность которых – наличие полупроницаемой мембраны, обладающей избирательной проницаемостью по отношению к компонентам разделяемой смеси. Мембранные технологии обладают явными преимуществами перед традиционными методами разделения:
– осуществление процесса при температуре окружающей среды без фазовых превращений и подвода тепла, что позволяет уменьшить потери термонестойких биологически активных веществ;
– малая энергоемкость;
– возможность одновременной очистки от низкомолекулярных примесей и концентрирования продуктов;
– исключение применения химических реагентов, что снижает стоимость процессов и уменьшает загрязнение сточных вод;
– универсальность – использование одной и той же установки для получения различных препаратов.
Среди мембранных методов преимущественное применение в биотехнологии получила ультрафильтрация, которая обеспечивает селективное концентрирование органических молекул и ионов. Промышленные ультрафильтрационные мембраны изготавливаются из различных материалов (ацетат целлюлозы, полиамид, полиакрилонитрил, фторопласт и др.). Они имеют существенный недостаток – невысокую водопроницаемость, которая составляет обычно 50–300 дм3/(м2 ∙ ч). Этот недостаток можно компенсировать только большой удельной поверхностью мембран в промышленных установках.
Принципиальное отличие ультрафильтрации от обычного фильтрования – отсутствие гетерогенности. Исходная смесь, а также продукт, прошедший через мембрану, – пермеат и продукт, оставшийся над мембраной, – концентрат находятся в жидкой фазе и различаются лишь составом, т. е. соотношением количеств компонентов. Образование осадка на поверхности мембраны резко ухудшает условия ее работы и недопустимо.
По способу укладки мембран различают установки с плоскими мембранными элементами, с трубчатыми, со спиральными, с мембранами в виде полых волокон. Установки с полыми волокнами имеют очень большую удельную поверхность фильтрования и, следовательно, высокую производительность. Ультрафильтрационный метод незаменим при концентрировании растворов ферментов, которые весьма чувствительны к воздействию повышенных температур.
В тонких биотехнологических процессах производства высокоактивных и дорогостоящих соединений применяют такие современные методы разделения веществ, как гель-хроматография, аффинная и препаративная жидкостная хроматография, хроматография на «молекулярных ситах».
В технологии получения биопрепаратов на основе жизнеспособных микроорганизмов наиболее ответственной операцией является обезвоживание биомассы, в результате которого клетки резко замедляют жизнедеятельность на длительное время, но сохраняют жизнеспособность. Для обезвоживания живых микроорганизмов (а также концентрата высокоактивных термолабильных метаболитов) наиболее пригодна сублимационная сушка, т. е. высушивание материала из замороженного состояния при температуре не выше 28°С без оттаивания при глубоком разрежении (влага переходит из твердого состояния в газообразное, минуя стадию жидкой фазы). Сублимационной сушке подвергают концентрат суспензии микроорганизмов, в который предварительно вводят криозащитные вещества, например, глицерин, мелассу, раствор глюкозы. Криопротекторы предотвращают механическое повреждение клеточных структур кристаллами льда, уменьшают концентрирование внутриклеточных электролитов, вызывающих денатурацию белка. На выживаемость клеток большое влияние оказывают скорость замораживания и остаточная влажность препарата, которые уточняют для данного объекта экспериментальным путем.
Сублимационная сушка является энергоемким и дорогостоящим процессом, но в производстве ряда биопрепаратов (прежде всего для медицинских целей) она незаменима.
В крупнотоннажных производствах сушку концентрированных суспензий микроорганизмов производят в высокопроизводительных распылительных сушилках при прямом контакте диспергированной до капелек суспензии с горячим воздухом или топочными газами от сжигания природного газа. Температура сушильного агента на входе в сушилку колеблется в пределах 150–350°С в зависимости от термоустойчивости продукта. Короткое время сушки (5–25 с) и низкая температура высушиваемого продукта (не более 45°С) позволяют избежать существенных потерь биологически активных веществ и использовать метод для сушки термолабильных продуктов, в том числе ферментных препаратов.