Происхождение и эволюция клеток

Следующий шаг по направлению к системам, иллюстрируемым рис. 1.1, представить труднее всего. При нормальной температуре спонтанная репликация, описанная выше, протекала бы медленно и с высоким процентом ошибок. Включение в этот процесс репликазы—белка, способного катализировать репликацию, существенно бы его ускорило. Каким образом это произошло—не ясно, но, возникнув, такая система получила преимущества. Более того, должны быть определенные преимущества в окружении матрицы и репликазы оболочкой, чтобы выгоды от их взаимодействия не могли использоваться другими, немного отличными матрицами-конкурентами. Так появилась клетка и разница между генотипом и фенотипом. На эти примитивные клетки отбор должен был действовать таким образом, что те из них, у которых взаимодействие между генотипом и фенотипом стимулировало скорость репликапии и ее точность, распространялись быстрее других. Хотя трудно точно представить себе ход событий, но именно в ходе взаимодействия и отбора возникли и совершенствовались сложные системы, включающие ДНК и различные формы РНК.

Первые клетки были мелкими и просто устроенными. Отчасти они напоминали современных бактерий, так называемых прокариот. В некоторых из них шло дальнейшее формирование мембран для отделения генетической информации от остального объема, что. вероятно, давало преимущества, поскольку обеспечивало лучшую защиту генетического материала от повреждений. Такие клетки, так называемые про-тоэукариоты, возможно, позднее приобрели цитоплазматические органеллы, из которых наибольшее значение имели митохондрии. Последние очень сходны со свободно-живущими прокариотами, напоминая их размерами, формой, наличием собственной ДНК и размножением путем деления надвое. Поэтому сейчас считается, что они возникли за счет симбиоза между мелкими прокариотами, похожими на ныне живущую бактерию Paracoccus, и более крупными, содержащими ядра протоэукариотами. Разрушая эукариотические клетки, можно показать, что весь механизм аэробного метаболизма связан именно с митохондриями, так что этот предполагаемый симбиоз развивался параллельно накоплению в земной атмосфере кислорода вследствие фотосинтетической активности древних циано-бактерий.

ДНК и РНК

В зависимости от того, какой моносахарид содержится в структурном звене полинуклеотида - рибоза или 2-дезоксирибоза, различают

• рибонуклеиновые кислоты (РНК) и
• дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК).

В главную (сахарофосфатную) цепь РНК входят остатки рибозы, а в ДНК – 2-дезоксирибозы.
Нуклеотидные звенья макромолекул ДНК могут содержать аденин, гуанин, цитозин и тимин. Состав РНК отличается тем, что вместо тимина присутствует урацил.

Молекулярная масса ДНК достигает десятков миллионов а.е.м. Это самые длинные из известных макромолекул. Значительно меньше молекулярная масса РНК (от нескольких сотен до десятков тысяч). ДНК содержатся в основном в ядрах клеток, РНК – в рибосомах и протоплазме клеток.

При описании строения нуклеиновых кислот учитывают различные уровни организации макромолекул: первичную и вторичную структуру.

• Первичная структура нуклеиновых кислот – это нуклеотидный состав и определенная последовательность нуклеотидных звеньев в полимерной цепи.

Например:

В сокращённом однобуквенном обозначении эта структура записывается как ...– А – Г – Ц –...

• Под вторичной структурой нуклеиновых кислот понимают пространственно упорядоченные формы полинуклеотидных цепей.

Вторичная структура ДНК представляет собой две параллельные неразветвленные полинуклеотидные цепи, закрученные вокруг общей оси в двойную спираль.

Такая пространственная структура удерживается множеством водородных связей, образуемых азотистыми основаниями, направленными внутрь спирали.

Водородные связи возникают между пуриновым основанием одной цепи и пиримидиновым основанием другой цепи. Эти основания составляют комплементарные пары (от лат. complementum - дополнение).

Образование водородных связей между комплементарными парами оснований обусловлено их пространственным соответствием. Пиримидиновое основание комплементарно пуриновому основанию:

Водородные связи между другими парами оснований не позволяют им разместиться в структуре двойной спирали. Таким образом,

• ТИМИН (Т) комплементарен АДЕНИНУ (А),
• ЦИТОЗИН (Ц) комплементарен ГУАНИНУ (Г).

Комплементарность оснований определяет комплементарность цепей в молекулах ДНК.

Комплементарность полинуклеотидных цепей служит химической основой главной функции ДНК – хранения и передачи наследственных признаков.
Способность ДНК не только хранить, но и использовать генетическую информацию определяется следующими ее свойствами:

· молекулы ДНК способны к репликации (удвоению), т.е. могут обеспечить возможность синтеза других молекул ДНК, идентичных исходным, поскольку последовательность оснований в одной из цепей двойной спирали контролирует их расположение в другой цепи (см. рисунок [113 Кб] или flash-иллюстрацию [101 Кб]).

· молекулы ДНК могут направлять совершенно точным и определенным образом синтез белков, специфичных для организмов данного вида.

Вторичная структура РНК. В отличие от ДНК, молекулы РНК состоят из одной полинуклеотидной цепи и не имеют строго определенной пространственной формы (вторичная структура РНК зависит от их биологических функций).
Основная роль РНК – непосредственное участие в биосинтезе белка. Известны три вида клеточных РНК, которые отличаются по местоположению в клетке, составу, размерам и свойствам, определяющим их специфическую роль в образовании белковых макромолекул:

• информационные (матричные) РНК передают закодированную в ДНК информацию о структуре белка от ядра клетки к рибосомам, где и осуществляется синтез белка;
• транспортные РНК собирают аминокислоты в цитоплазме клетки и переносят их в рибосому; молекулы РНК этого типа "узнают" по соответствующим участкам цепи информационной РНК, какие аминокислоты должны участвовать в синтезе белка;
• рибосомные РНК обеспечивают синтез белка определенного строения, считывая информацию с информационной (матричной) РНК.

· Какие бывают РНК полимеразы. За что они отвечают. Как устроен промотор класса II.

· У эукариот есть три различные РНК полимеразы - I, II и III, представляющие собой мультибелковые комплексы и ответственные за транскрипцию с соответствующих промоторов: класс I (гены, кодирующие рибосомальные РНК), II (гены, кодирующие матричные РНК и некоторые малые ядерные РНК) и III (гены, кодирующие транспортные РНК и оставшиеся малые ядерные РНК).

· Эукариотические РНК полимеразы не способны сами по себе инициировать транскрипцию. Для этого им необходимы вспомогательные белки - факторы инициации, формирующие совместно с полимеразами преинициаторные комплексы.

· РНК полимераза II узнаёт промоторы класса II. Промотор класса II можно разделить на базальный (коровый), проксимальный и дистальный элементы.

· Классический базальный элемент промотора класса II содержит (i) ТАТА-бокс - последовательность, лишённую GC пар расположенную приблизительно за 25 пар оснований от участка старта транскрипции, и (ii) инициаторный элемент - специфическую нуклеотидную последовательность, находящуюся в районе старта. Существуют неканонические промоторы класса II, не содержащие ТАТА или инициатора.

· Проксимальные элементы располагаются в пределах 50-200 пар оснований от участка старта транскрипции и содержат сайты связывания белков - активаторов транскрипции.

· Дистальные элементы, представляющие собой энхансеры, могут располагаться на произвольном расстоянии в любой ориентации по отношению к участку старта транскрипции.

· Какие факторы нужны для инициации транскрипции РНК полимеразой II. Формирование преинициаторного комплекса, его судьба в процессе инициации.

· Для правильной инициации транскрипции РНК полимеразой II в зоне корового элемента промотора должны собраться соответствующие инициаторные факторы, называемые TFII (Transcription Factors of RNA polymerase II). Среди них: TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF и TFIIH. Из вышеупомянутых факторов лишь TFIID способен напрямую взаимодействовать с промоторной областью ДНК, остальные факторы удерживаются в промоторной области посредством белок-белковых взаимодействий друг с другом и с TFIID.

· Специфическое связывание TFIID с ДНК является начальным этапом инициации транскрипции. В основе этого события лежит специфическое взаимодействие ТАТА - связывающего компонента TFIID (TBP - TATA Binding Protein) с соответствующим участком ДНК.

· Связывание TBP с ТАТА-боксом запускает каскад событий, приводящий к формированию преинициаторного комплекса: с TBP-TATA комплексом связывается инициаторный фактор TFIIB, с TFIIB связывается преформированный комплекс полимеразы II с инициаторным фактором TFIIF. Считается, что таким образом реализуется одна из функций TFIIB, состоящая в правильном позиционировании полимеразы относительно промотора. С TFIIF связывается инициаторный фактор TFIIE, с TFIIE связывается фактор TFIIH. На этом формирование преинициаторного комплекса заканчивается.

· В преинициаторном комплексе TFIIH проявляет киназную активность - фосфорилирует С - концевой домен большой субъединицы РНК полимеразы II. Тем временем хеликаза АТФ - зависимо расплетает двойную спираль ДНК в районе старта транскрипции. Формируется так называемый "открытый" комплекс. Полимераза уходит с промотора и начинает элонгацию. После ухода полимеразы TFIID остаётся связанным с коровым элементом промотора в течение некоторого времени и может принять участие в новом раунде инициации. После терминации транскрипции специальная фосфатаза возвращает большую субъединицу полимеразы в дефосфорилированное состояние. Таким образом восстанавливается способность полимеразы инициировать транскрипцию.

· 4. В состав ДНК встреч часто повторяют послед нуклеотидов, умеренно, уникально?

· Всю ДНК эукариотическо!о генома можно разделить на 2 класса последовательностей. . Во-первых это уникальные или неповторяющиеся

· последовательное™ которые представлены одной или 2-мя копиями на дишюидный хромосомный набор. Именно они включают в себя основную массу

· генов. На долю этих уникальных последовательностей приходиться до 70% клеточной РНК.

· Второй класс - повторяющиеся последовательности ДНК. В свою очередь их принято делить на высоко нов горяющиеся последовательности и умерено

· повторяющиеся последовательности.

· Высоко повторяющиеся последовательности состоя из участков ДНК длиной 5-500 пар нуклеотидов повторенных от 1 до 10 млн. раз. Доказано, что они

· не несут генетической информации и транскрипционно .неактивны. Такие высоко повторяющиеся последовательности вероятнее всего участвуют в

· структурной организации хроматина. На этот тип последовательностей приходиться примерно 15% общей длины ДНК хромосомы.

· Умерено повторяющиеся последовательности присутствуют в количестве менее чем 1 млн. копий на геном. Они могут иметь различную длину от

· нескольких пар нуклеотидов до нескольких тысяч пар. Часть этих умеренно повторяющихся последовательное гей представляет собой тандемы генов

· (блоки генов например гистонов). Часть представляют собой гены некоторых классов структурных РНК. Умеренно повторяющиеся последовательности

· активно транскрибируются. Вместе с тем часть умеренно повторяющихся последовательностей выполняют структурную функцию (например входит в

· состав участков ДНК разделяющих отдельные гены - спейсоры). На эти последовательности приходиться примерно 10-20% хромосомных ДНК.

Проведение ПЦР

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp^[8]). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований ^[9].

Компоненты для амплификации ( процесс образования дополнительных копий участков хромосомной ДНК, как правило, содержащих определенные гены либо сегменты структурного гетерохроматина.)

ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент);

Праймеры (синтетические олигонкулеотиды (20-30 нуклеотидных пар.(Праймер – одноцепочечный фрагмент ДНК, образующий затравку на ДНК-матрице ). Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа;

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК);

Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК);

Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента).

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий (рис. 2).

Денатурация

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Отжиг

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называетсяотжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

Элонгация

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы в направлении от 3' к 5'. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадиюфинальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин.

На главную страницу

• ⇐ Назад
• 123
• 4
• 5
• Далее ⇒