III. Учтите и оцените результаты непрямой РИФ с сывороткой обследуемого и антигеном боррелий – возбудителем Лайм-боррелиоза.

Педиатрия

ЗАНЯТИЕ 27

Тема: Микробиологическая диагностика сифилиса, возвратных тифов, Лайм-боррелиоза, лептоспироза.

Цель: На основе знаний биологии патогенных спирохет, особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновать тактику микробиологической диагностики, профилактику и терапию, вызываемых ими заболеваний.

Знать:

1. Классификацию и морфо-биологические особенности возбудителей сифилиса, возвратных тифов, Лайм-боррелиоза, лептоспироза.

2. Экологию, особенности патогенеза и иммунитета при сифилисе, возвратных тифах, Лайм-боррелиозе, лептоспирозе.

3. Материал и методы микробиологической диагностики сифилиса, возвратных тифов, Лайм-боррелиоза, лептоспироза.

4. Специфическую профилактику и терапию лептоспироза.

5. Неспецифическую профилактику и этиотропную терапию сифилиса, возвратных тифов, Лайм-боррелиоза.

Уметь:

1. Учитывать и оценивать результаты реакции микропреципитации, РНГА при серологической диагностике сифилиса.

2. Идентифицировать патогенные спирохеты по морфо-тинкториальным свойствам и характеру движения.

3. Учитывать и оценивать результаты непрямой РИФ при серодиагностике Лайм-боррелиоза.

Контрольные вопросы:

1. Систематическое положение возбудителей сифилиса, возвратных тифов, Лайм-боррелиоза, лептоспироза.

2. Морфобиологическая характеристика возбудителей сифилиса, возвратных тифов, Лайм-боррелиоза, лептоспироза.

3. Экология, эпидемиология, особенности патогенеза и иммунитета при сифилисе, возвратных тифах, Лайм-боррелиозе, лептоспирозе.

4. Материалы и методы микробиологической диагностики сифилиса, возвратных тифов, Лайм-боррелиоза, лептоспироза.

5. Специфическая профилактика и терапия лептоспироза.

6. Неспецифическая профилактика и этиотропная терапия сифилиса, возвратных тифов, Лайм-боррелиоза.

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Провести серодиагностику сифилиса, для чего:

1.1. Поставить, учесть и оценить результаты реакции микропреципитации с инактивированными сыворотками обследуемых (С1, С2, СЗ, С4, С5).

1.2. Учесть и оценить результаты РПГА с сыворотками обследуемых, у которых реакция микропреципитации положительна.

На основании полученных результатов сформулировать вывод.

2. Провести исследование крови обследуемого с подозрением на возвратный тиф, для чего:

2.1. Промикроскопировать препараты «толстая капля» из крови больных «А» и «Б», взятой на высоте приступа лихорадки (окраска по Романовскому-Гимзе).

2.2. Промикроскопировать препараты «толстая капля» из крови морских свинок, зараженных кровью больных «А» и «Б» (окраска по Романовскому-Гимзе).

По результатам исследования сформулировать вывод; заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.

3. Учесть и оценить результаты непрямой РИФ с сывороткой обследуемого и антигеном боррелий – возбудителей Лайм-боррелиоза.

4. Промикроскопировать препарат из осадка мочи больного с выраженной желтухой (импрегнация серебром по Морозову).

5. Описать биопрепараты: антиген для реакции Вассермана, кардиолипидный антиген для реакции микропреципитации, лептоспирозный гаммаглобулин, лептоспирозная вакцина, лептоспирозная агглютинирующая сыворотка.

Методические указания, выполняемые в ходе УИРС:

I. Проведите серологическое исследование по обнаружению антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови обследуемых, для чего:

1.1. Поставьте, учтите и оцените результаты реакции микропреципитации с инактивированными сыворотками крови обследуемых (С1, С2, СЗ, С4, С5).

Техника постановки реакции микропреципитации (МПР):пастеровской пипеткой набирают инактивированную сыворотку крови каждого обследуемого и вносят по 3 капли в лунки планшета, куда затем добавляют по 1-й капле кардиолипинового антигена. Ингредиенты смешивают встряхиванием планшета в течение 5-ти минут, добавляют 3 капли физ. раствора, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 минут (оптимальный температурный режим реакции 23-28°С). Одновременно ставят контроли сывороток: КС"+"- сыворотка, заведомо содержащая антитела к возбудителю сифилиса, КС"-"-сыворотка, заведомо не содержащая антитела к возбудителю сифилиса.

Учет: результат учитывают визуально по появлению хлопьев в лунках, что является свидетельством положительной реакции.

Критерии достоверности: положительная МПР с контрольной сывороткой КС"+" и отрицательная реакция - с контрольной сывороткой КС"-".

Оценка: положительная реакция микропреципитации свидетельствует о возможном наличии антител в сыворотке обследуемых и выявлении заболевания сифилисом. Отрицательный результат свидетельствует о серологическом не подтверждении заболевания.

В настоящее время при серодиагностике сифилиса рекомендовано использовать в качестве скрининговых (отборочных) методов МПР с кардиолипиновым антигеном, РСК с кардиолипиновым антигеном – реакцию Вассермана (приказ МЗ РФ №87 от 26.03.2001 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса»). Поскольку МПР технически более простая, требует меньше времени на постановку, то при серологической диагностике она используется чаще.

1.2. Учтите и оцените результаты РПГА с сыворотками обследуемых, у которых МПР была положительна (см. занятие № 10).

МПР и РСК не являются специфическими и в ряде случаев дают ложноположительный результат. Для распознавания ложноположительных результатов и подтверждения результатов отборочных реакций используют специфические, чувствительные реакции. К их числу относятся РПГА, ИФА, РИТ (реакция иммобилизации трепонем), РИФн. Недостатками РИТ и РИФн является техническая сложность, длительность постановки, высокая стоимость исследования; кроме того, приблизительно у 85% адекватно пролеченных больных эти реакции остаются положительными в течение нескольких лет и даже в течение всей жизни, поэтому не могут быть использованы в качестве контроля излеченности.

На основании полученных результатов сформулируйте вывод.

II. Проведите исследование крови обследуемого с подозрением на возвратный тиф, для чего:

2.1. Промикроскопируйте препараты «толстая капля» из крови больных «А» и «Б», взятой на высоте приступа лихорадки (окраска по Романовскому-Гимзе).

Микроскопический метод является основным при микробиологической диагностике возвратных тифов. С учетом патогенеза заболевания исследуемым материалом является кровь, забираемая на высоте приступа, из которой готовят препарат «толстая капля». На высушенный нефиксированный препарат наливают краситель Романовского-Гимза (соотношение основного раствора красителя и дистиллированной воды 1:10), время окраски 40-45 мин. Затем препарат осторожно промывают, высушивают и микроскопируют.

Боррелии возвратных тифов – это спирохеты сине-фиолетового цвета, длиной 10-20 мкм и толщиной 0,2-0,5 мкм, имеющие 3-10 неравномерных завитков.

2.2. Промикроскопируйте препараты «толстая капля» из крови морских свинок, зараженных кровью больных «А» и «Б» (окраска по Романовскому-Гимзе).

Для дифференциации эпидемического и эндемического возвратных тифов используют биопробу на морских свинках. Для этого кровь больного вводят подкожно лабораторным животным, через 5-6 дней из крови готовят препарат «толстая капля», который окрашивают по Романовскому-Гимзе. Обнаружение в препарате боррелий свидетельствует об эндемическом возвратном тифе. Это зоонозная инфекция, возбудителями которой являются B. caucasica, В. hispanica, B. latyschewii и др. Возбудитель эпидемического возвратного тифа – антропонозная инфекция, возбудитель которой B. recurrentis не патогенен для морских свинок.

На основании полученных результатов сформулируйте вывод; заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.

III. Учтите и оцените результаты непрямой РИФ с сывороткой обследуемого и антигеном боррелий – возбудителем Лайм-боррелиоза.

Серологический метод является основным при микробиологической диагностике Лайм-боррелиоза. Лайм-боррелиоз - это природно-очаговая, зоонозная, трансмиссивная инфекция, эндемичная для территории Красноярского края. Одной из реакций, применяемой для серодиагностики Лайм-боррелиоза, является непрямая РИФ.

На предметное стекло наносят антиген – инактивированную культуру возбудителя Лайм-боррелиоза (B. garinii, B. afzelii); мазки высушивают, фиксируют и наносят сыворотку обследуемого в разведении 1:200. Препарат выдерживают во влажной камере при 37°С в течение 30 мин (1 фаза). После этого препарат промывают буферным раствором, наносят антиглобулиновую сыворотку, меченную флюорохромом, и выдерживают при комнатной t° в течение 30 мин (2 фаза). Мазки промывают буферным раствором и микроскопируют в люминесцентном микроскопе. В случае положительного результата в препарате выявляют светящиеся характерные по морфологии микроорганизмы. При помощи РИФн можно определить титр антител в сыворотке обследуемого, нанося ее в различных разведениях на ряд приготовленных препаратов.