Тема: Микробиологическая диагностика кандидозов.
Пед.ф-т, 2006
ЗАНЯТИЕ 28
Тема: Микробиологическая диагностика кандидозов.
Цель: На основе знаний биологии дрожжеподобных грибов рода Candida, особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновать тактику микробиологической диагностики, профилактику и терапию, вызываемых ими заболеваний.
Знать:
1. Классификацию и морфобиологические особенности дрожжеподобных грибов рода Candida.
2. Особенности экологии, эпидемиологии, патогенеза и иммунитета при заболеваниях, вызываемыхдрожжеподобными грибами рода Candida.
3. Материал и методы микробиологической диагностики заболеваний, вызываемых дрожжеподобными грибами рода Candida.
4. Профилактику и терапию заболеваний, вызываемых дрожжеподобными грибами рода Candida.
Уметь:
1. Микроскопировать препараты из исследуемого материала для изучения дрожжеподобных грибов рода Candida и интерпретировать полученные результаты.
2. Учитывать, оценивать и интерпретировать результаты посева на хромогенные среды исследуемого материала при диагностике заболеваний, вызываемых дрожжеподобными грибами рода Candida.
3. Учитывать и оценивать результаты определения чувствительности дрожжеподобных грибов рода Candida к антимикотикам с помощьюFUNGITEST.
Контрольные вопросы:
1. Виды дрожжеподобных грибов рода Candida, играющие роль в патологии человека.
2. Морфобиологические особенности C.albicans как основного возбудителя заболеваний кандидозной этиологии.
3. Особенности экологии, эпидемиологии, патогенеза и иммунитета при заболеваниях, вызываемыхдрожжеподобными грибами рода Candida.
4. Заболевания, вызываемые дрожжеподобными грибами рода Candida, у детей.
5. Материал и методы микробиологической диагностики заболеваний, вызываемыхдрожжеподобными грибами рода Candida.
6. Интерпретация результатов при микроскопическом и микологическом исследованиях с целью диагностики заболеваний, вызываемыхдрожжеподобными грибами рода Candida.
7. Профилактика и терапия заболеваний, вызываемыхдрожжеподобными грибами рода Candida.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
1. Провести микологическое исследование беременной (III триместр) с клиническим диагнозом «Кандидозный вульвовагинит»:
1.1. Ознакомиться с транспортной средой, тампонами для взятия и транспортировки материала.
1.2. Промикроскопировать препарат из влагалища (окраска по Граму) и оценить полученный результат.
1.3. Изучить посев исследуемого материала на среду Candi-select:
- подсчитать количество характерных колоний;
- приготовить фиксированный препарат из изолированной колонии, окрасить по Граму, промикроскопировать.
1.4. Ознакомиться с тест-системойAUXACOLORдля биохимической идентификации дрожжеподобных грибов. В случае необходимости учесть и оценить результаты.
1.5. Учесть и оценить результаты определения чувствительности исследуемой культуры к противогрибковым препаратам с помощью микропанели FUNGITEST.
На основании полученных результатов сделать вывод о видовой принадлежности исследуемой культуры, ее чувствительности к противогрибковым препаратам и диагностической значимости полученных результатов. Заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
2. Описать биопрепараты: кандидозный антиген для РСК, кандидозный аллерген.
Методические указания к выполнению исследовательского задания:
I. Проведите микологическое исследование беременной (III триместр) с клиническим диагнозом «Кандидозный вульвовагинит»
Первичное инфицирование новорожденных происходит в родовых путях, чему способствует увеличение частоты носительства дрожжеподобных грибов рода Candida на слизистой оболочке влагалища женщин в конце беременности. Дрожжеподобные грибы рода Candida выявляют в 10-20% случаев у здоровых небеременных женщин, у беременных – в 25-33% случаев, а при угрозе прерывания беременности – у 65-75% женщин. Поэтому большое значение имеет микробиологическое обследование беременных с целью предупреждения инфицирования новорожденных.
1 этап. Материал из влагалища забирают после введения гинекологического зеркала стерильным ватным тампоном с задней стенки или с патологически измененных участков. Тампон помещают в пробирку с транспортной средой (Стюарта и др.).
Помимо взятия материала на посев врач-гинеколог или специально обученная медсестра готовит мазки для микроскопии, используя отдельные стерильные тампоны. Материал равномерно распределяют на предметном стекле мягкими движениями, избегая грубого втирания и резких штриховых движений.
Стекла и пробирки с исследуемым материалом доставляют в баклабораторию. Стекла окрашивают по Граму, а материал из влагалища засевают методом «штрих с площадкой» на ½ чашки Петри с соответствующей питательной средой (Candi-select и др.)
Доказательством этиологической роли грибов рода Candida при микроскопическом исследовании является выявление в исследуемом материале многочисленных клеток округлой и овальной формы и псевдомицелия; последний отличается от истинного мицелия отсутствием общей оболочки и перегородок и состоит из длинных клеток, соприкасающихся друг с другом узким основанием. Псевдомицелий является патогенетической формой грибов рода Candida. Обнаружение единичных, округлых или овальных клеток при микроскопическом исследовании материала из открытых очагов поражения не имеет диагностического значения.
2 этап.Изучите результаты посева исследуемого материала на среде Candi-select: подсчитайте количество характерных колоний,приготовьте фиксированный препарат из изолированной колонии, окрасьте по Граму, промикроскопируйте.
Для уменьшения времени исследования в микробиологической практике используют хромогенные среды, которые позволяют сочетать получение культуры с ее идентификацией. При этом время на собственно идентификацию вообще не тратится. При микробиологической диагностике кандидозов такой средой является Candi-select (Bio-Rad, Sanofi Diagnosticts Pasteur). Это селективная среда, содержащая питательную основу для роста грибов, хромогенный субстрат для определения N-ацетил b-D-галактозамидазы C. albicans и два антибиотика, хлорамфеникол и гентамицин, которые подавляют рост бактериальной микрофлоры. Идентификация C. albicans, основного клинически значимого вида среди дрожжеподобных грибов, основана на выявлении ее специфического фермента N-ацетил b-D-галактозамидазы, который гидролизуя хромогенный субстрат, приводит к окрашиванию колоний в голубой цвет. В мазке C. albicans имеет вид округлых или овальных, одиночных и почкующихся клеток, окрашенных по Граму в фиолетовый цвет. Учет результатов осуществляется через 24-48 ч.
В том случае, если вырастают колонии белого цвета, то проводят идентификацию с помощью тест-системы AUXACOLOR (Bio-Rad, Sanofi Diagnosticts Pasteur) (см. приложение 1).
Так как C. albicans относится к условно-патогенным микроорганизмам и выявляется в составе нормальной микрофлоры слизистых оболочек половых органов, в оценке результатов микологического исследования диагностическое значение имеет их количество. Диагностически значимым является также выделение C. albicans при повторном исследовании.
Для количественной оценки результатов, полученных при штриховом посеве тампоном на ½ чашки используют следующие критерии:
- степень 1 – очень скудный рост (на плотных питательных средах роста нет, рост только в жидкой питательной среде);
- степень 2 – небольшое количество – 1-10 колоний;
- степень 3 – умеренное количество – 11-100 колоний;
- степень 4 – большое количество – более 100 колоний.
Результат, соответствующий 1 и 2 степени, свидетельствует о контаминации исследуемого материала нормальной микрофлорой; 3-4 степени – об этиологической роли выделенного микроорганизма (Приказ МЗ СССР № 535 от 22.04.1985).
3 этап.Учтите и оцените результаты определения чувствительности исследуемой культуры к противогрибковым препаратам с помощью микропанели FUNGITEST.
В числе новых методов определения чувствительности грибов рода Candida к противогрибковым препаратам является использование тест-системы FUNGITEST (Bio-Rad, Sanofi Diagnosticts Pasteur).
FUNGITEST используется для определения чувствительности грибов к 6 противогрибковым препаратам в 2-х различных концентрациях на специальной питательной среде, содержащей индикатор, который, в случае роста грибов, меняет цвет с голубого на красный. Когда рост грибов задерживается за счет противогрибковых препаратов, среда остается синей.
Микропанель состоит из 16 микролунок, содержащих:
- Т+ - положительный контроль роста;
- Т- - отрицательный контроль роста;
- лунки с 6-ю противогрибковыми препаратами в 2-х различных концентрациях.
Учет и оценка результатов осуществляется через 48 ч культивирования при 37°С; наличие 2-х концентраций противогрибковых препаратов позволяет получить профиль чувствительности тестируемых грибов (чувствительная, умеренно устойчивая, устойчивая).
Критерием достоверности полученных результатов является наличие роста и изменение цвета индикатора с голубого на красный в лунках Т+ и отсутствие роста и изменение цвета индикатора в лунках Т-.
Примеры:
AB 2 AB 8 синяя /синяя чувствительная
KET 0,5 KET 4 красная /красная устойчивая