V Учет результатов амплификации
Результаты исследования учитывают путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в агарозном геле (Набор III - для проведения электрофореза).
4.1 Приготовление буфера для электрофореза
Для приготовления 1 л однократного буфера для электрофореза к 20 мл 50хТАЕ буфера добавить 980 мл дистиллированной воды и 40 мкл раствора бромистого этидия.
Буфер можно приготовить самостоятельно по следующей прописи: навеску 4,04 г Триса растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 0,5 М раствора ЭДТА рН 8,0 и доводят объём буфера до 1000 мл дистиллированной водой. После растворения компонентов буфера добавляют 40 мкл раствора бромистого этидия.
4.2 Приготовление 2% агарозного геля
К 100 мл однократного буфера для электрофореза добавляют 2 г агарозы, доводят до кипения и охлаждают до 450С. Заливают в специальную форму с гребёнкой и дают затвердеть. Гребёнку осторожно вынимают и форму с агарозным гелем переносят в аппарат для горизонтального электрофореза (ПГ-9 “Диа - М”) и погружают в буфер.
4.3 Электрофорез продуктов амплификации
К 7 мкл полученной амплификационной смеси (водной фазы) добавляют 3 мкл буфера для нанесения образца, перемешивают пипетированием. Полученные образцы вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребёнки.
Электрофорез проводят при напряжении 8 вольт/см длины геля. Краситель должен пройти не менее половины геля.Направление движения образцов в геле от “-” к “+“!
4.4 Учет результатов электрофореза
Результаты электрофореза просматривают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм на приборе "Трансиллюминатор". Результаты реакции выявляются в виде светящихся красноватых полос.
Положительными считают пробы, полосы в которых располагаются в геле точно на таком же расстоянии от старта, что и полосы положительного контроля. В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос.
Исследуемые пробы считают отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т. е. располагаются на другом расстоянии от старта). Размер фрагментов после проведения ПЦР – 180 п.н.
Присутствие в отрицательном контроле окрашенных фрагментов на уровне полос положительного контроля свидетельствует о перекрестной контаминации в процессе анализа. Результаты аннулируются. Анализ необходимо провести заново.
Для документирования полученных результатов используют фотопленку «Микрат – 300» и аппарат типа "Зенит” с оранжевым светофильтром, либо другие фото- и видеосистемы.
V меры личной Профилактики
5.1 Бромистый этидий является мутагеном, проникающим через кожу. При работе с ним использовать резиновые перчатки.
5.2 Ультрафиолет вызывает ожоги слизистой оболочки глаз. При просмотре гелей пользоваться защитным экраном или очками.
5.3 Работу с химическими компонентами и биологическим материалом следует проводить с соблюдением правил техники безопасности. При случайном попадании компонентов на кожу или слизистые оболочки рекомендуется промыть это место большим количеством водопроводной воды.
5.4 Запрещается во время работы с компонентами тест-системы прием пищи, воды, курение.
5.5 Тест-систему следует хранить в местах, недоступных для детей.
Инструкция разработана ООО «Ветбиохим». Организация-производитель – ООО «Ветбиохим». Адрес производства: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д.16
С утверждением настоящей инструкции утрачивает силу инструкция по применению тест-системы для обнаружения патогенных лептоспир методом полимеразной цепной реакции, утвержденная Россельхознадзором 21 августа 2007 г.
Рекомендовано к регистрации в Российской Федерации ФГУ ВГНКИ.
Регистрационный номер ПВР -1-1.2/00928