Идентификация Shigella flexneri
Грамотрицательные факультативно-анаэробные палочки
1. предварительное неселективное обогащение:
· ЗПВ (забуференная пептонная вода): посевы инкубируют при температуре (37±1)°С в течение (18±2) ч. Для большего эффекта перед внесением анализируемой пробы продукта ЗПВ нагревают до (37±1)°С, т. е. до температуры инкубирования посевов.
2. селективное накопление:
· жидкая элективная среда Кода: культивировать признаком роста лактозоотрицательных энтеробактерий (шигелл) является помутнение среды без изменения цвета.
· среда с охмеленным суслом: культивировать
· селективный обогатительный бульон для шигелл: инкубируют при температуре (37±1)°С в течение (24±2) ч.
3. плотные дифференциально-диагностические среды:
· питательная среда Эндо: посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1)°С и 18-20 ч. Проводят учет ферментации лактозы. Колонии круглые бесцветные или слегка розоватые. Образование полупрозрачных бесцветных или бледно-розовых колоний свидетельствует о принадлежности микроорганизмов, давших рост на накопительных питательных средах, к лактозоотрицательным энтеробактериям, в том числе шигелл.
Бактерии рода Shigella не ферментируют лактозу, сахарозу, ксилозу, не декарбоксилируют лизин и не образуют сероводород.
· ксилоза лизин дезоксихолатный агар (XLD агар): посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1)°С и (24±2) ч. На ксилозализин дезоксихолатном агаре проводят учет ферментации лактозы, сахарозы, ксилозы, декарбоксилирование лизина, образование сероводорода. Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на XLD агаре, имеют красный цвет, который принадлежит цвету индикатора. Колонии круглые, блестящие, бледно-розовые или цвета среды, диаметром 1,0-1,5 мм.
· среда Левина: посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1)°С и 24-48 ч. Проводят учет ферментации лактозы. Колонии круглые бесцветные прозрачные или слегка розоватые, слегка приподнятые над поверхностью питательной среды, с глянцевой поверхностью и ровным краем.
Бактерии рода Shigella не ферментируют салицин.
· гектоеновый энтероагар: посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1)°С и (24±2) ч. На гектоеновом энтероагаре проводят учет ферментации лактозы, сахарозы, салицина, образование сероводорода. Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на гектоеновом энтероагаре, имеют зеленый или голубоватый цвет.
· сальмонелла-шигелла агар (SS-агар): посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1)°С и 18-20 ч. На SS-агаре проводят учет ферментации лактозы, образование сероводорода. Колонии круглые бесцветные или слегка розоватые.
Бактерии рода Shigella не обладают сульфитредуцирующими свойствами.
· висмут-сульфит агар (ВСА): посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1)°С и (24±2) ч. На ВСА учет ферментации глюкозы, обнаружения сульфитредуцирующих свойств. Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на ВСА, имеют серо-зеленый цвет.
· среда Плоскирева (бактоагар Плоскирева): посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1)°С и 18-20 ч. Проводят учет ферментации лактозы. Колонии круглые бесцветные или слегка розоватые. Колонии круглые бесцветные прозрачные или слегка розоватые, слегка приподнятые над поверхностью питательной среды, с глянцевой поверхностью и ровным краем. Бесцветные, нежные, гладкие, круглые диаметром 1,0-2,0 мм.
· дезоксихолатный цитратный агар: посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1)°С и (24±2) ч. Проводят учет ферментации лактозы. Колонии круглые бесцветные или слегка розоватые.
· скошенный РПА (ПА): культивирование – 37°С 18-20 ч. Бесцветный прозрачный рост по штриху.
4. морфология клеток:
· Shigella flexneri грамотрицательные палочки с закругленными концами.
5. биохимические тесты:
У отобранных и предварительно пересеянных культур изучают характерроста на ТСА (TSI) агаре, или агаре Клиглера, или среде Олькеницкого, возможностьрасщепления мочевины, образования ацетоина, утилизации цитрата, наличиеL-лизин декарбоксилазы и подвижность.
· общие положения
Петлей инокулируют специфические среды – ТСА (TSI) агар, или агар Клиглера, или среду Олькеницкого каждой культурой, полученной из колоний на скошенном РПА (ПА).
· ТСА (TSI) агар, среда Олькеницкого или агар Клиглера засевают штрихом скошенную поверхность агара и уколом столбик. Инкубируют при температуре (37±1)°С в течение (24±2) ч. Интерпретируют изменения в среде:
а) столбик:
- желтый глюкозу ферментирует (реакция
положительная)
- красный или не
изменившийся
глюкозу не ферментирует (реакция
отрицательная)
- черный образование сероводорода
- пузырьки или разрывы образование газа при ферментации
глюкозы
б) Скошенная поверхность
- желтая лактозу и (или) сахарозу ферментирует
(реакция положительная)
- красная или не
изменившаяся
лактозу и (или) сахарозу не ферментирует
(реакция отрицательная). Агар Клиглера
содержит два сахара (глюкозу и лактозу),
поэтому по скошенной поверхности
учитывают только ферментацию лактозы
Типичные культуры бактерий рода Shigella показывают щелочную
(красную) поверхность и кислый (желтый) столбик без образования газа
(пузырьков), сероводород (черный агар) не образуется.
Отношение выделенных культур к бактериям рода Shigella не может
основываться только на результатах теста на TSI агаре или на агаре Клиглера,
или среде Олькеницкого.
Дальнейшему изучению подвергают бактерии, показавшие типичные
характеристики на TSI агаре или на агаре Клиглера, или среде Олькеницкого.
При учете результатов роста выявленных бактерий на трехсахарном агаре
(агаре Клиглера, среде Олькеницкого) учитывают рост, типичный для
бактерий рода Salmonella, руководствуясь требованиями ГОСТ 31659. Если
подобный рост бактерий обнаружен, то дальнейшее испытание проводят с
учетом возможного присутствия бактерий рода Salmonella.
8.5.3.3 Агар с мочевиной (агар Кристенсена) (5.2.9)
Культуры пересевают штрихом на поверхность агара Кристенсена с
мочевиной. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч,
наблюдая за посевами через определенные промежутки времени.
При положительной реакции, расщеплении мочевины с выделением
аммония, цвет фенолового красного изменяется от розового до сильного
светло-вишневого.
Для уреазоположительных бактерий реакция в основном становится
видимой после 2 ч инкубирования.
Бактерии рода Shigella не расщепляют мочевину.
8.5.3.4 Определение L-лизин декарбоксилазы (5.2.10)
Инокулируют снизу жидкую среду для определения L-лизин
декарбоксилазы (5.2.10). Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в
течение (24±2) ч.
Помутнение и пурпуровый цвет после инкубации указывают на
положительную реакцию. Желтый цвет указывает на отрицательную реакцию.
Бактерии рода Shigella не обладают L-лизиндекарбоксилазой (реакция
отрицательная).
8.5.3.5 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера)
(5.2.12)
Анализируемую культуру суспензируют петлей в стерильной пробирке,
содержащей 3 см VP среды (5.2.11) или мясо-пептонного бульона с глюкозой
(5.2.6).
Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч.
После инкубации прибавляют две капли раствора креатина, три капли
спиртового раствора 1-нафтола и две капли раствора гидроокиси калия,
перемешивают содержимое пробирки после прибавления каждого реактива.
Образование от розового до светло-красного цвета после 15 мин
указывает на положительную реакцию.
Бактерии рода Shigella не образуют ацетоин (реакция Фогес-Проскауера
отрицательная).
Допускается определение ацетоина проводить без применения раствора
креатина. Для этого после инкубирования к 1 см отобранной культуральной
жидкости прибавляют 0,6 см раствора 1-нафтола и 0,2 см раствора
гидроокиси калия, содержимое пробирки перемешивают после прибавления
каждого реактива.
Появление розового окрашивания через 15 мин указывает на
положительную реакцию.
8.5.3.6 Определение подвижности
Культуры пересевают уколом в полужидкий питательный агар (5.2.17) или
полужидкий мясо-пептонный агар (5.2.18).
Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч.
При росте подвижных культур отмечается диффузионный рост по всему
столбику агара, при росте неподвижных культур - вдоль места укола.
Бактерии рода Shigella неподвижны.
8.5.3.7 Определение утилизации цитрата
Культуру высевают в пробирки со средой Козера (5.2.13) или на
поверхность среды Симмонса (5.2.14). Посевы инкубируют при температуре
(37±1) °С в течение 24-48 ч. Изменение оливково-зеленого цвета сред на
васильковый (или синий) указывает на положительную реакцию.
Бактерии рода Shigella не утилизируют цитрат.
8.5.3.8 Интерпретация биохимических тестов приведена в таблице Г.1
приложения Г.