Единицы выражения активности ферментов.
Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных, согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции. Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности в условных единицах Комиссией по ферментам Международного биохимического союза была рекомендована стандартная международная единица (Е или U): за единицу активности любого фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 микромоля субстрата или образование 1 микромоля продукта в минуту (мкмоль/мин).
В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено новое выражение активности фермента в каталах (кат, kat): 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 молю в 1 с (1 моль/с). Отношение международной единицы (U) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат = 1 моль•с–1 = 60 моль•мин–1 = 60•106 мкмоль•мин–1 = 6•107 U, или: 1 U = 1 мкмоль•мин–1 = (1/60) мкмоль•с–1 = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Таким образом, 1 U фермента соответствует 16,67 нкат.
Рекомендовано, кроме того, измерять активность фермента при температуре 25°С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и будет зависеть только от концентрации фермента.
Для выражения активности в практической работе с ферментами часто пользуются произвольными понятиями удельной и молярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Количество молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в продукт в процессе реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом, принято называть числом оборотов фермента, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль фермента). Одна молекула каталазы эритроцитов способна, например, расщепить в 1 с 44000 молекул перекиси водорода.
Изоферменты.
Изоферменты, или изоэнзимы — это различные по аминокислотной последовательности изоформы или изотипы одного и того же фермента, существующие в одном организме, но, как правило, в разных его клетках, тканях или органах.
Изоферменты, как правило, высоко гомологичны по аминокислотной последовательности и/или подобны по пространственной конфигурации. Особенно консервативны в сохранении строения активные центры молекул изоферментов. Все изоферменты одного и того же фермента выполняют одну и ту же каталитическую функцию, но могут значительно различаться по степени каталитической активности, по особенностям регуляции или другим свойствам.
Примером фермента, имеющего изоферменты, является гексокиназа, имеющая четыре изотипа, обозначаемых римскими цифрами от I до IV. При этом один из изотипов гексокиназы, а именно гексокиназа IV, экспрессируется почти исключительно в печени и обладает особыми физиологическими свойствами, в частности её активность не угнетается продуктом её реакции глюкозо-6-фосфатом.
Ещё одним примером фермента, имеющего изоферменты, является амилаза — панкреатическая амилаза отличается по аминокислотной последовательности и свойствам от амилазы слюнных желёз, кишечника и других органов. Это послужило основой для разработки и применения более надёжного метода диагностики острого панкреатита путём определения не общей амилазы плазмы крови, а именно панкреатической изоамилазы.
Третьим примером фермента, имеющего изоферменты, является креатинфосфокиназа — изотип этого фермента, экспрессируемый в сердце, отличается по аминокислотной последовательности от креатинфосфокиназы скелетных мышц. Это позволяет дифференцировать повреждения миокарда (например, при инфаркте миокарда) от других причин повышения активности КФК, определяя миокардиальный изотип КФК в крови.