Микроскопический (бактериоскопический) метод.
Суть метода: из исследуемого материала по общепринятой методике готовят мазок, окрашивают его и путем микроскопического изучения обнаруживают микробы, исследуют их морфологические, тинкториальные свойства, расположение микробов в мазке относительно друг друга. На сновании полученных данных делают заключение об этиологии заболевания.
Достоинства метода:быстрое получение результатов, техническая и экономическая доступность, простота.
Недостатки метода. Морфология, особенно родственных микроорганизмов, нередко идентична, и они не идентифицируются в световом микроскопе. Под действием ряда факторов внешней среды, в первую очередь, антибиотиков микроорганизмы могут изменять свою характерную морфологию. Концентрация возбудителей может быть чрезвычайно низкой, поэтому они не обнаруживаются, или форменные элементы их маскируют. Эти обстоятельства приводят к тому, что этот метод редко используется как окончательный способ установления этиологии заболевания. Чаще он используется как ориентировочный, предварительный метод исследований, а при некоторых видах инфекции он вообще опускается. Бактериолог, получив ориентировочные сведения о предполагаемом возбудителе, его концентрации, сочетании с сопутствующей микрофлорой, определяет тактику дальнейшего выделения чистой культуры возбудителя.
Бактериологический метод.
Суть бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя и его дальнейшей идентификации, т.е. установления видовой принадлежности по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, серологическим свойствам, отношению к бактериофагам, бактериоцинам и т.д.
Бактериологический метод распадается на несколько этапов:
а) ориентировочное бактериоскопическое исследование (проводится не при всех исследованиях);
б) выделение искомого возбудителя в чистой культуре;
в) идентификация выделенного в чистой культуре возбудителя.
Выделение чистой культуры проводится в 3 этапа.
1-й этап исследования
Выделение чистой культуры может проводиться двумя путями:
а) посевом на плотные питательные среды – здесь имеется выигрыш во времени. В качестве плотных питательных сред для рассева исследуемого материала чаще берут МПА, элективно-селективные и дифференциально-диагностические среды;
б) опосредованно– посев делается сначала на среды накопления; метод более длительный , вероятность выделения возбудителя выше.
На практике, как правило, используют оба эти способа параллельно.
2-й этап исследования .
Изучение характера роста на жидких и плотных питательных средах. Отбор подозрительных колоний, приготовление из них мазков с окраской по Граму и последующей микроскопией. Для получения чистой культуры в количестве, достаточном для ее дальнейшей идентификации, подозрительные колонии пересевают на скошенный питательный агар, а в ряде случаев - на дифференциально-диагностические среды (например, на среду Ресселя). Посевы выдерживают в термостате при благоприятной температуре в течение времени, необходимом для роста возбудителя времени.
Следует отметить, что отбор подозрительных колоний – ответственный и трудный этап работы. Он основан, прежде всего, на характере роста колоний микробов. Однако одна характеристика колоний не всегда позволяет дифференцировать микроорганизмы, поэтому приходится проводить дополнительное изучение морфологии микробов в мазках из подозрительных колоний, на дифференциально-диагностических средах учитывать ферментативную активность, а иногда прибегать к изучению антигенной структуры.
3-й этап исследования
А. Контроль чистоты культуры на скошенном питательном агаре):
1) визуальный (рост культуры должен быть однородным, гомогенным;
2) микроскопический – приготовление мазка, окраска его по Граму, микроскопия (в поле зрения должны быть одинаковые по форме и окраске микроорганизмы) .
Б.Идентификация выделенной чистой культуры.Для этого используют морфологические, тинкториальные, культуральные, ферментативные особен-
ности, антигенные свойства, фагочувствительность, вирулентность и т.д..
Принадлежность к классу, порядку, семейству, иногда даже к роду можно установить на основании морфологии и тех сведений предварительного изучения, которые мы получаем в ходе выделения чистых культур.
Чтобы определить род микробов, в большинстве случаев необходимо знание их физиолого-биохимических признаков. Проводится определение совокупности нескольких тестов
Морфология бактерий изучается обязательно в мазке из культур, окрашенном по методу Грама, иногда – в дополнительных мазках, окрашенных специальными методами. Подвижность определяется, как правило, посевом уколом в столбик хорошо осветленного полужидкого агара (рост по уколу говорит о том, что микробы неподвижны, рост с помутнением – что они подвижна). Чаще подвижность изучают путем микроскопии препаратов «висячей» или «раздавленной» капли.
Культуральные свойства изучаются в процессе выделения чистой культуры микроорганизмов они включают сведения о характере колоний, о росте на поверхности скошенного агара по штриху, о росте на жидких средах. Специально изучается, например, валообразование у сальмонеллы паратифа В или ползучий рост у протея.
Ферментативная активность. Сахаролитические свойства изучаются на средах с углеводами; протеолитические – на белковых средах. “Пестрый ряд (или среды Гиса) включает в себя набор питательных сред, каждая из которых содержит один из углеводов, а также пробирку с МПБ с индикаторными бумажками для выявления индола и сероводорода Применяются также различные пробы, например: Фогес-Проскауэра - на биосинтез ацетилкарбинола; пробы с крахмалом или с желатином (определяется характер его разжижения), пробы на восстановление нитратов, проба с молоком , протеолиз казеина, оксидазная и каталазная пробы, исследование отношения к высоким температурам или к повышенной концентрации NaCl и т.д
Антигенная структура. Бактериальная клетка обладает сложной антигенной структурой, что часто выражается в виде антигенной формулы. У многих микроорганизмов имеется О-антиген, Н-антиген, К-антиген. Как правило, антигенная структура изучается путем постановки реакции агглютинации на стекле с использованием в качестве антител иммунных диагностических видовых и типовых сывороток.
Предварительная принадлежность к роду или группе видов может быть определена с использованием поливалентных сывороток.
Если используется неадсорбированная видовая сыворотка, положительная реакция на стекле дополняется развернутой пробирочной – для исключения возможной положительной реакции за счет групповых антител.
Фаголизабельность определяется путем постановки реакции фаголизиса с использованием видового индикаторного бактериофага. В случае наличия фаготипов микроба-возбудителя определение ведется в тех же реакциях, но с использованием типового индикаторного бактериофага.
Изучение патогенности на лабораторных животных проводится не всегда, т.к. тест малодоступен, продолжителен по времени. Он применяется, главным образом, при диагностике ООИ. На практике обычно ограничиваются определением отдельных факторов вирулентности: гемолитической, плазмокоагулирующей активности, выявлением экзотоксина в реакции преципитации в агаре и т.д.
4-й этап исследования.Учет полученных результатов и выдача ответа.
Биологический метод.
Суть метода. Материал, взятый от больного, “проводится” через организм восприимчивого лабораторного животного. На высоте развития клинических проявлений животное усыпляют, вскрывают и проводят бактериоскопическое и бактериологическое исследование крови из сердца, экссудатов полостей, паренхиматозных органов. Диагноз ставят по наличию типичной клинической картины заболевания у животного, а также по выделению и идентификации возбудителя заболевания.
Серологические методы.
В основе любого серологического метода лежит взаимодействие между специфическими антителами и антигенами. Исследуемым материалом служат сыворотка крови больного, в которой выявляются специфические антитела, или исследуемый материал, содержащий возбудителя или его антигены..
Серодиагностика– поиск неизвестных антител с использованием известных антигенов. В качестве антигенов может быть использован известный микроб (или его антигены), вытяжки и экстракты из органов и тканей (антигенные диагностикумы).
Цель исследования – определить наличие специфических антител, их количество (титр антител сыворотки крови). В ходе заболевания количество антител в сыворотке больного увеличивается, поэтому исследуют парные сыворотки больного, взятые с интервалами 7-14 дней. Увеличение титра антител во второй пробе сыворотки подтверждает диагноз.
Сероидентификация-поиск неизвестных антигенов (микробов, их антигенов) в исследуемом материале, взятом от больного, с использованием известных антител (антительные, сывороточные, иммуноглобулиновые диагностикумы). Антительные диагностикумы получают путем иммунизации экспериментальных животных соответствующими антигенами.
Наиболее часто для серологической диагностики используют реакции агглютинации, преципитации, лизиса, реакции с использованием меченых антигенов или антител.
Достоинствоство cерологических методов – высокая чувствительность и специфичность, относительная быстрота получения результатов, универсальность методик.
Аллергологический метод.
Метод позволяет поставить диагноз инфекционного заболевания с помощью накожных и внутрикожных аллергических проб. Метод выявляет состояние гиперчувствительности замедленного типа, возникающее при ряде инфекционных болезней. Введение соответствующего аллергена сопровождается появлением в месте введения гиперемии, отека, припухлости. Метод используется для диагностики бруцеллеза, туляремии, туберкулеза, токсоплазмоза и других заболеваний.
3.2.6. Экспресс-методыпозволяют поставить диагноз инфекционного заболевания в короткие сроки (световая микроскопия, иммунофлюоресценсия)