Учебное пособие для студентов заочной формы обучения 5 страница

N N O H₂ -C-O- ú ê ÷ ê АДФ (аденозин-

1¢ -P-O~P-OH дифосфат)

H H H H ê ê

OH OH

OH OH O O O

÷ ê ÷ ê ÷ ê АТФ (аденозин-

-P-O~P-O ~P-OH трифосфат)

ï ï ï

OH OH OH

Приводим строение рибонуклеозидфосфатов на примере семейства аденозина.

Знаком “~“ в формулах НТФ и НДФ обозначены высокоэнергетические фосфатные связи (макроэргические связи).

Для нормальной жизнедеятельности клетки важное значение имеют все НТФ, но среди них особое место занимает АТФ. Большая часть энергии. освобождающейся в процессе брожения, дыхания, фотосинтеза запасается в виде АТФ, который называют “биологически универсальной энергетической валютой”. АТФ во всех клетках выступает в качестве депо для хранения и переноса химической энергии (на молекулярном уровне). Он действует как связующее звено между процессами, производящими энергию и процессами, требующими затраты энергии. При этом его высокоэнергетические фосфатные группы непрерывно отщепляются и заменяются новыми.

В клетках содержатся мононуклеиды не обнаруживаемые в нуклеиновых кислотах. Среди них можно назвать никотинамидмононуклеотид, флавинмононуклеотид и кофермент А (см. витамины). Они также имеют важное значение в обмене.

Среди динуклеотидов, имеющих важное значение в обмене веществ, в клетках содержатся никотинамидадениндинуклеотид (НАД), никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ), флавинадениндинуклеотид (ФАД). Все они содержат в качестве одного нуклеотида АМФ, а другим нуклеотидом у НАД и НАДФ служит никотинамидмононуклеотид, у ФАД - флавинмононуклеотид. Во всех трех динуклеотидах мононуклеотидные единицы связаны между собой ангидридной связью; их фосфатные группы образуют 5¹, 5¹-пирофосфатный мостик. Напоминаем, что в нуклеиновых кислотах нуклеотиды связаны между собой 3¹¾®5¹-фосфодиэфирной связью, Для примера приводим химическую формулу НАД:

O NH₂

ú ç ê

C-NH₂ N N

O O

+ 5¢ ÷ ç ÷ ç 5¢ N

N O H₂C O P O P O CH₂ O N

ê ê

H H H H ОН ОН H H H H

OH OH OH OH

Никотинамидмононуклеотид Аденозинмонофосфат

Строение и биологическая роль мононуклеотидов и динуклеотидов более подробно описаны в разделах ферменты и витамины.

ГЛАВА 4. ФЕРМЕНТЫ

4.1.Общее понятие о ферментах. Иммобилизованные ферменты

Ферменты, или энзимы - это биологические катализаторы, образующиеся и функционирующие во всех живых организмах. Из приведенных названий в литературе на русском языке принят термин “ферменты”, а процессы, происходящие с участием этих катализаторов - ферментативными.

Вещество, превращение которого катализирует фермент, получило название с у б с т р а т.

Ферменты являются важнейшими компонентами клетки, они тесным образом связаны с разнообразными процессами жизнедеятельности, их роль как биокатализаторов биохимических превращений подобна роли катализаторов в других химических реакциях. По определению И.П.Павлова “ферменты есть... первый акт жизнедеятельности... они... возбудители всех химических превращений... основной пункт, центр тяжести физиолого-химического знания”.

Ферменты идеально приспособлены для работы в живой клетке, но после выделения из клетки они не теряют свои каталитические свойства. На этом основано практическое применение ферментов в химической, пищевой, легкой и фармацевтической промышленности.

Принцип связывания ферментов с различными структурами клетки в настоящее время используют в биотехнологии. При этом ферменты прикрепляют (иммобилизуют) к поверхности какого-либо твердого носителя (целлюлоза и ее производные, полиакриламид, пористое стекло, нейлон, алюмосиликаты и др.), что позволяет не только сохранить их каталитические свойства, но и повысить стабильность. Такие ферменты получили название и м м о б и л и з о в а н н ы х.

Иммобилизованные ферменты обладают рядом преимуществ по сравнению с природными предшественниками: во-первых, их можно легко отделить от реакционной среды и использовать повторно; во-вторых, процесс можно вести непрерывно (в проточных колоннах) и, изменяя скорость потока, регулировать скорость каталитической реакции и выход продукта. Иммобилизованные ферменты успешно используют для получения глюкозы из крахмала, получения глюко-фруктозного сиропа и в ряде других крупнотоннажных производств.

4.2. Химическая природа и строение ферментов. Активный центр ферментов

Установлено, что все известные в настоящее время ферменты представляют собой белки.

Ферменты обладают теми же физико-химическими свойствами, что и белки. Их молекулярная масса колеблется от десятков тысяч до нескольких миллионов. По форме молекул ферменты относятся к глобулярным белкам.

Все ферменты подразделяют на две большие группы: о д н о к о м п о н е н т н ы е и д в у х к о м п о н е н т н ы е. К первой группе относят ферменты, состоящие только из белка, а ко второй - состоящие из белка и связанной с ним небелковой части (активная группа или кофактор). Белковая часть двухкомпонентного фермента носит название а п о ф е р м е н т, небелковая часть - п р о с т е т и ч е с к а я группа или кофермент, а молекула в целом - х о л о ф е р м е н т.

Прочность связи между белковой и небелковой частями у различных ферментов различна. В связи с этим небелковую часть, сравнительно прочно связанную с апоферментом называют п р о с т е т и ч е с к а я группа, а небелковую часть, сравнительно легко удаляющуюся через полупроницаемую мембрану при диализе - к о ф е р м е н т.

В качестве кофакторов двухкомпонентных ферментов может функционировать значительное число органических и неорганических веществ. Из органических соединений функцию кофакторов выполняют многие витамины, нуклеотиды (ФМН и др.), динуклеотиды (НАД, НАДФ, ФАД), железопорфирины (гем и гематин), липоевая кислота, и другие соединения.

Из неорганических веществ функцию кофакторов выполняют ионы различных металлов: цинка, меди, железа, молибдена, никеля, марганца, магния, кальция и др. В одних ферментах металлы бывают довольно прочно связаны с белком и не отделяются от него в процессе очистки. В других ферментах металл непрочно связан с белком и легко отделяется от него в процессе очистки.

А к т и в н ы й ц е н т р. Известно, что размеры ферментов намного превышают размеры субстратов или функциональных групп, на которые они действуют. Это дало основание предполагать, что субстрат соединяется не со всей молекулой фермента, а с отдельным его участком, получившим название “а к т и в н ы й ц е н т р”, т.е. та область фермента, в которой происходит связывание и превращение субстрата.

Активный центр образуется радикалами аминокислотных остатков полипептидной цепи при формировании ее третичной структуры; у двухкопонентных ферментов в состав активного центра входят и некоторые группировки небелковой части. Достройка активного центра двухкомпонентных ферментов происходит после взаимодействия апофермента с небелковой частью. Нарушение третичной структуры фермента под влиянием различных факторов приводит к дефомации активного центра и изменению ферментативной активности.

Наиболее часто в состав активных центров ферментов входят радикалы серина, гистидина, треонина, цистеина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Активный центр функционально неоднороден; в нем условно выделяют “каталитически активный” участок, где происходит превра-щение субстрата (расщепление или синтез связи), и так называемый контактный или “якорный” участок, который обеспечивает связывание субстрата с ферментом.

Рис 4.1 Модель молекулы фермента

А - третичная структура молекулы; Б - силуэт молекулы с активным центром (в рамке).

В молекуле фермента может присутствовать а л л о с т е р и ч е с к и й центр, представляющий собой участок молекулы, присоединение к которому определенных веществ приводит к изменению третичной структуры молекулы фермента. В результате этого происходит изменение конфигурации активного центра, сопровождающееся либо увеличением, либо снижением каталитической активности фермента. Это явление лежит в основе так называемой аллостерической регуляции активности ферментов. Ферменты, активность которых регулируется веществами, присоединяющимися к аллостерическому центру, получили название а л л о с т е р и ч е с к и х ферментов.

4.3 Механизм ферментативного катализа

Химическая реакция имеет определенный “энергетический барьер” и может произойти только в том случае, если реагенты (реагирующие молекулы) обладают запасом энергии, достаточным для достижения ими вершины этого барьера и перехода в промежуточное состояние, называемое а к т и в и р о в а н н ы м комплексом или п е р е х о д н ы м с о с т о я н и е м. В переходном состоянии возможно одновременное образование новых и разрыв старых химических связей.

Активация молекул может происходить при повышении температуры, в результате поглощения ими лучистой энергии, при столкновении с другими возбужденными молекулами или атомами,передающими им часть своей энергии. Количество энергии, необходимое для достижения при данной температуре всеми молекулами одного моля вещества переходного состояния, соответ-ствующего вершине энергетического барьера, называется э н е р г и е й а к т и в а ц и и. Иначе, энергия активации представляет собой “энергетический барьер”, который нужно преодолеть для того, чтобы произошла реакция.

В присутствии катализатора понижается энергия активации . Причем фермент снижает энергию активации значительно сильнее, чем неорганический катализатор.

Согласно теории Михаэлиса-Ментен фермент (Е) соединяется со своим субстратом (S), образуя нестойкий промежуточный комплекс (ES), который в конце реакции распадается с освобождением фермента и продуктов реакции. Поэтому всю последовательность каталитического ферментативного процесса можно представить следующим образом:

E + S ES EX EP E + P,

где ЕХ - истинный активированный комплекс (переходное состояние); ЕР - комплекс фермента с продуктом.

В самой общей форме можно сказать, что молекула субстрата, после связывания с активным центром фермента, поляризуется, электроны в ней перераспределяются, расположение электрических зарядов изменяется, связи деформируются и все это приводит к повышению ее активности.

4.4. Обратимость действия ферментов

Реакции, катализируемые многими ферментами обратимы, т.е. один и тот же фермент в зависимости от определенных условий может катализировать реакцию в обоих направлениях. В 1884г.

Обратимость действия ферментов бесспорно доказана вне организма. Однако в живой клетке большинство ферментативных синтезов (см. обмен веществ) происходит под действием других ферментов, а не тех, которые катализируют расщепление того или иного соединения и, следовательно, не благодаря обратимости действия ферментов. Это, по-видимому, связано с тем, что в живой клетке в большинстве случаев происходит удаление продуктов реакции и, кроме того, реакции синтеза и соответствующие им реакции распада часто локализованы в разных участках, или отсеках (компартментах) клетки. Такая компартментализация гарантирует независимое протекание процессов синтеза и распада и обеспечивает благоприятные энегргетические условия для них.

4.5. Специфичность ферментов

Под специфичностью ферментов понимают способность каждого из них катализировать одну или несколько близких по природе хими-ческих реакций. Это одно из важнейших биологических явлений, без которого невозможен упорядоченный обмен веществ в живом организме, а следовательно, и сама жизнь.

Исследуя природу ферментативного катализа Э.Фишер в 1890-х годах пришел к выводу, что специфичность ферментов можно уподобить соответствию между “ключом и замком”. При этом под-разумевается, что активный центр фермента имеет жесткую структуру, подобно замку. Молекула субстрата должна иметь комплементарную структуру, чтобы входить в активный центр, подобно ключу (рис 4.2). Представление Э.Фишера об активном центре фермента, как жесткой структуре, не подвергалось сомнению в течение полустолетия.

По мере изучения механизма действия ферментов был выявлен ряд данных, которые нельзя согласовать с теорией “ключа и замка”. Например, фермент не может атаковать (подвергнуть превращению) молекулы веществ, обладающие меньшим или большим размером по сравнению с субстратом, но имеющие такие же группы для взаимодействия с ферментом, что и субстрат. Следует отметить, что в ряде случаев такие молекулы связываются с контактным участком активного центра, но при этом превращение субстрата не происходит.

Специфичность у разных ферментов выражена в неодинаковой степени. Различают следующие типы специфичности.

1. А б с о л ю т н а я с п е ц и ф и ч н о с т ь. При этом типе специфичности фермент катализирует превращение только одного субстрата. Фермент каталаза катализирует расщепление пероксида водорода на воду и кислород; ее действие ограничивается только этим субстратом.

Рис 4.2. Схема связывания фермента и субстрата согласно теории “ключа и замка”

Обозначение: E- фермент; S-субстрат; Р - продукты; ES- комплекс фермент-субстрат; ЕХ - истинный активированный комплекс; А - активный центр фермента.

2. Г р у п п о в а я с п е ц и ф и ч н о с т ь. Основным признаком для ферментов этого типа специфичности служит характер разрушаемой или создаваемой связи в близких по строению группах веществ. К ферментам с групповой специфичностью относятся липазы, катализирующие гидролиз сложных эфиров глицерина и карбоновых кислот; фосфатазы, действующие на эфиры фосфорной кислоты; пептидгидролазы, катализирующие гидролиз пептидных связей в белках и пептидах и др.

3. С т е р е о х и м и ч е с к а я с п е ц и ф и ч н о с т ь. Ферменты этого типа специфичности действуют на определенный изомер одного и того же вещества: D- или L-, a- или b- , транс- или цис- . Пептидгидролазы действуют только на пептиды, образованные аминокислотами L-ряда.

4.6. Кинетика ферментативных реакций

Химическая кинетика - это учение о скоростях и механизмах хи-мических реакций. Ферментативная кинетика изучает закономерности влияния химической природы реагирующих веществ (фермента, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация фермента, концентрация субстратов или ингибиторов) на скорость ферментативных реакций.

4.6.1. Измерение скорости ферментативных реакций

Мерой скорости ферментативной реакции служит количество субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени, или количество образовавшегося продукта.

4.6.2. Единицы активности ферментов

Для выражения каталитической активности Комиссией по ферментам Международного биохимического союза (1961 г.) была рекомендована стандартная единица, обозначенная на русском языке - Е, а на английском - U.

С т а н д а р т н а я е д и н и ц а - это такое количество фермента, которое при заданных условиях катализирует превращение одного микромоля субстрата за одну минуту.

В 1972 г. Комиссия по ферментам Международного биохимического союза предложила выражать активность ферментов в к а т а л а х. Катал (символ - кат - это такое количество фермента, которое способно превращать один моль субстрата за одну секунду (при оптимальных условиях).

К производным величинам, характеризующим активность ферментов, относят удельную каталитическую активность ферментов, концентрацию фермента в растворе и другие. Удельную каталитическую активность фермента или ферментативного препарата выражают в каталах на 1 кг белка (кат·кг^-1) или чаще в мккат на 1мг белка. Концентрацию фермента в растворе выражают в каталах на 1 литр (кат·л^-1) или в других, кратных этому значению величинах.

4.6.3. Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции

Ферментативные реакции, в отличие от неферментативных, обладают очень важной особенностью - насыщения фермента субстратом. Эта особенность проявляется в том, что при постоянной концентрации фермента скорость реакции имеет характерную зависимость от концентрации субстрата. При низких концентрациях субстрата скорость реакции пропорциональна концентрации субстрата и по отношению к нему - это реакция первого порядка. С увеличением концентрации субстрата приращение скорости с каждым разом уменьшается и, наконец, она становится практически независимой от концентрации субстрата. В этих условиях реакция по отношению к субстрату - нулевого порядка, а весь фермент полностью насыщен субстратом и не может функционировать быстрее. Скорость ферментативной реакции при полном насыщении фермента субстратом называется м а к с и м а л ь н о й с к о р о с т ь ю.

V_max · [S ]

V =

К_m + [S ]

Это окончательное уравнение, выведенное для односубстратной реакции, называют у р а в н е н и е м М и х а э л и с а - М е н т е н. Данное уравнение позволяет легко измерять максимальную скорость из экспериментальных данных, полученных при любой фиксированной концентрации фермента. График зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата представляет собой гиперболу (рис. 4.3).

V_max Рис. 4.3. Зависимость

скорости реакции

катализируемой

ферментом, от

1/2 V_max концентрации

субстрата.

[S] К _m - константа Михаэлиса

K_m

4.6.4 Влияние концентрации фермента на скорость ферментативной реакции

При высокой концентрации субстрата и при постоянстве других факторов скорость ферментативной реакции зависит от концентрации фермента. При построении графика эта зависимость будет линейной (рис. 4.4).

Рис. 4. Влияние концентрации фермента на скорость реакции: V - скорость реакции; [E] - концентрация фермента.

V [E]

В клетках организма и в производственных условиях катализ всегда осуществляется в условиях, когда концентрация фермента гораздо ниже концентрации субстрата.

4.6.5 Влияние температуры на скорость ферментативной реакции

Важным фактором, от которого зависит скорость ферментативной реакции (равно каталитическая активность фермента) является температура, влияние которой показано на рис 4.5. Из рисунка видно, что с повышением температуры до определенной величины скорость реакции увеличивается. Это можно объяснить тем, что с повышением температуры движение молекул ускоряется и у молекул реагирующих веществ оказывается больше возможности столкнуться друг с другом. Это увеличивает вероятность того, что реакция между ними произойдет. Температура, обеспечивающая наибольшую скорость реакции, называется о п т и м а л ь н о й температурой.

Каждый фермент имеет свою оптимальную температуру. В общем для ферментов животного происхождения она лежит между 37 и 40^ОС, а растительного - между 40 и 50^ОС. Однако есть и исключения: a-амилаза из проросшего зерна имеет оптимальную температуру при 60^ОС, а каталаза - в пределах 0 - 10^ОС. При повышении температуры сверх оптимальной скорость ферментативной реакции снижается, хотя частота столкновений молекул увеличивается. Происходит это вследствие денатурации, т.е. потери ферментом нативного состояния. При температуре выше 80^ОС большинство ферментов полностью теряют свою каталитическую активность.

Снижение скорости ферментативной реакции при температурах, превышающих оптимальную, зависит от денатурации фермента. Поэтому важным показателем, характеризующим отношение фермента к температуре, является его термолабильность, т.е. скорость инактивации самого фермента при повышении температуры.

Рис. 4.5. Влияние температуры на скорость гидролиза крахмала амилазой.

При низких температурах (0 ^ОС и ниже) каталитическая активность ферментов падает почти до нуля, но денатурация при этом не происходит. С повышением температуры их каталитическая активность вновь восстанавливается.

4.6.6 Влияние рН на скорость ферментативной реакции

Важным фактором, оказывающим большое влияние на скорость ферментативной реакции, является рН среды.

Для каждого фермента существует оптимальное значение рН, т.е. такая величина рН, или зона рН, при которой катализируемая ферментом реакция протекает с наибольшей скоростью (рис. 4.6).

Большинство ферментов имеют максимальную каталитическую активность в зоне рН от 7; в резко кислой или резко щелочной среде

Рис. 4.6. Влияние рН на скорость реакции, катализируемой пепсином (1) и сахарозой из дрожжей (2).

работают лишь некоторые ферменты. За пределами оптимальной зоны рН, т.е. при отклонениях в сторону снижения или в сторону повышения от этого значения, скорость ферментативной реакции снижается.

При разных значениях рН активный центр может находиться в разной степени ионизированной или неионизированной форме, что сказывается на формировании активного фермент-субстратного комплекса. Кроме того, имеет значение факт ионизации субстатов и кофакторов.