Размножение бактерий в жидкой питательной среде.

Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питатель­ной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и пре­кращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой си­стеме называют периодическим культивированием, а культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивиро­вание называется непрерывным, а культура — непрерывной.

 

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов:1. лаг-фаза;2. фаза логарифмического роста; 3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрациибактерий; 4. фаза гибели бактерий.

 

Лаг-фаза — период между по­севом бактерий и началом размножения. Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом ин­тенсивного деления бактерий. Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жиз­неспособных клеток остается без изменений, составляя макси­мальный уровень Завершает процесс роста бактерий фаза гибели, характеризующаяся отмиранием бак­терий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолирован­ные колонии округлой формы с ровными или неровными кра­ями (S- и R-формы), различной консистенции и цве­та, зависящего от пигмента бактерий.

 

Многие пигменты обладают ан­тимикробным, антибиотикоподобным действием.

 

Термин «рост»означает увеличение цитоплазматической массы отдельной клетки или группы бактерий в результате синтеза клеточного материала (например, белка, РНК,ДНК). Достигнув определенных размеров, клетка прекращает рост и начинает размножаться.

Под размножением микробов подра;зумевают способность их к самовоспроизведению, увеличению количества особей на единицу объема. Иначе можно сказать: размножение — это повышение числа особей микробной популяции.

 

Скорость размножения бактерий различна и зависит от вида микроба, возраста культуры, питательной среды, температуры.

При выращивании бактерий в жидкой питательной среде наблюдается несколько фаз роста культур:

1. Фаза исходная (латентная) — микробы адаптируются к питательной среде, увеличивается размер клеток. К концу этой фазы начинается размножение бактерий.

2. Фаза логарифмического инкубационного роста — идет интенсивное деление клеток. Длится эта фаза около 5 часов. При оптимальных условиях бактериальная клетка может делиться каждые 15—30 мин.

3. Стационарная фаза — число вновь появившихся бактерий равно числу отмерших. Продолжительность этой фазы выражается в часах и колеблется в зависимости от вида микроорганизмов.

4. Фаза отмирания — характеризуется гибелью клеток в условиях истощения питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма микроорганизмов.

5ч 10 15 20 25 30 35 40 45 Время нед нед

Если питательная среда, в которой культивируются микроорганизмы, будет обновляться, то можно поддерживать фазу логарифмического роста.

При размножении на плотных питательных средах бактерии образуют на поверхности среды и внутри нее типичные для каждого микробного вида колонии. Колонии могут быть выпуклыми или плоскими, с ровными или неровными краями, с шероховатой или гладкой поверхностью и иметь различную окраску: от белой до черной. Все эти особенности (культуральные свойства) учитывают при идентификации бактерий, а также при отборе колоний для получения чистых культур. Чтобы знать, как получить чистую культуру того или иного микроорганизма, надо внимательно ознакомиться с практической частью данной главы.

4. 20 Бактериологический метод диагностики: суть, этапы и их цель, последовательность выполнения работы.

Бактериологический метод исследования является важнейшим в практической деятельности любой микробиологической лаборатории. От правильного его выполнения зависит определение этиологического фактора, который вызывал заболевание, и, соответственно, выбор тактики лечения инфекционного больного. Важность этого метода объясняется тем, что во многих случаях врачи имеют дело с микробными ассоциациями, тогда необходимо устанавливать роль каждого из микробов в возникновении болезни.

Потому перед освоением основных принципов и методов выделения чистых культур необходимо овладеть техникой посевов и пересеваний бактерий в жидких и на плотные питательные среды.

Техника посевов микроорганизмов. Посевы проводят как с целью выделение возбудителей из исследуемого материала от больных, так и для нагромождения чистых культур с целью последующего их изучения и идентификации. Техника посевов в жидких и на плотные питательные среды имеет свои особенности.

В левую руку берут две пробирки. В одной находится питательная среда (плотное или жидкое), в другой – исследуемый материал. Пробирки зажимают большим и указательным пальцами. Для того, чтобы можно было наблюдать за содержанием пробирок, их держат сверху кисти руки. Пробирки должны быть кое-что наклоненными, и нужно следить, чтобы при открытии их материал или посторонние микробы зповитря и окружающих предметов из одной не попали в другую. Пробки из пробирок вынимают, держа их 4 и 5 пальцами правой руки. Тремя другими пальцами правой руки, как карандаш, держат бактериологическую петлю или пипетку, которыми распределяют исследуемый материал.

Сначала стерилизуют петлю в верхней части пламени газовой горелки. Пробирки открывают и край их проносят через пламя горелки. Петлю опускают в пробирку, где есть исследуемый материал, и, осторожно касаясь стенки, охлаждают. В последующем петлю опускают в пробирку и набирают материал. Если он находится в жидком состоянии, для посева достаточно капли жидкости, которая задерживается в кильке бактериологической петли. Когда используют микробов, которые выросли на поверхности среды, осторожно плавным движением набирают небольшое количество их, следя, чтобы не повредить питательную среду. Петлю медленно вынимают из пробирки, не касаясь ее стенок, и переносят в другую пробирку со средой. Штриховыми движениями от одной стенки пробирки к другой, начиная с нижней части среды, проводят занял материалу по скошенной поверхности агара снизу кверху.

Петлю вынимают из пробирки, пробки и края пробирок проносят через пламя и закрывают. Петлю прожаривают в пламени, чтобы уничтожить микроорганизмы.

При посеве материала на жидкую питательную среду петлю с материалом окунают в жидкость. Если он не снимается из петли, его осторожно растирают на стенке пробирки и омывают средой.

Материал, который набирали пастеровской или градуированной пипеткой, выливают в питательную среду, а для равномерного распространения его пробирку осторожно, чтобы не замочить пробку, стряхивают или вращают, зажав в ладонях.

Для посева материала на плотную питательную среду в чашках Петри небольшое количество материала набирают стерильной петлей и втирают в поверхность среды возле края чашки.

 

Посев петлей

 

После этого петлю стерилизуют в пламени, чтобы уничтожить избыток материала, охлаждают. Следующий этап посева начинают с места, где закончился предыдущий. Петлю кладут горизонтально на поверхность агара, где было сделано занял, проводят один-два разы по поверхности и делают занял по остальным среды. Необходимо пытаться, чтобы штрихи посева длились от края к краю чашки, не повреждали поверхности агара и располагались близко друг к другу. Этим искусственно продлевается линия посева и создаются возможности для получения изолированных колоний.

Посев шпателем и тампоном в чашки Петри. Материал предварительно наносят на поверхность питательной среды возле края чашки петлей или пипеткой. Стерильный шпатель проносят через пламя, охлаждают, касаясь стенки чашки. Осторожными круговыми движениями, держа чашку полузакрытой, распределяют материал равномерно по поверхности среды.

 

Посев шпателем

 

При посеве тампоном чашку кое-что открывают одной рукой, тампоном касаются поверхности агара возле края чашки и начинают проводить занял штрихами от края к краю чашки, втирая осторожно материал в поверхность среды, не повреждая его, постепенно вращая тампон. После проведения посева чашку вращают на 90°и повторяют занял перпендикулярно к предыдущему.

При посеве уколом в столбик питательной среды пробирку с м’ясо-пептонним агаром, желатином и тому подобное берут в левую руку, петлю с материалом – в праву и делают укол к дну пробирки в среду. Петлю осторожно вынимают, а пробирку закрывают.

Посев материала в толщу питательной среды. Перед посевом материал должен быть в жидком состоянии. Стерильной градуированной пипеткой набирают 0,1, 0,5 или 1,0 мл материалу и выливают его в стерильные чашки Петри. После этого материал заливают 15-20 мл растопленного и охлажденного до 45-50 °С МПА. Осторожно покачивая чашку, круговыми движениями по поверхности стола перемешивают в ней материал, достигая его равномерного деления в среде. Чашку оставляют закрытой к полному застудневанию агара, а затем переворачивают вверх дном.

Для того, чтобы выделить чистую культуру микроорганизмов, следует отделить многочисленные бактерии, которые находятся в материале, одна от другой. Это можно достичь с помощью методов, которые основаны на двух принципах – механическом и биологическом разобщении бактерий.

Механический принцип	Биологический принцип
МЕТОДЫ 1. Фракционных разведений Л. Пастера 2. Пластинчастых разведений Р. Коха 3. Поверхностных посевов Дригальського 4. Поверхностных штрихов	МЕТОДЫ Приймают во внимание: а - тип дыхания (метод Фортнера); б - подвижность (метод Шукевича); в - кислотоустойчивость; г - спорообразование; д - температурный оптимум; е - избирательную чувствительность лабораторных животных к бактериям

Метод разведений

 

Метод поверхностных штрихов.

 

Методы выделения чистых культур, основанные на механическом принципе

Метод последовательных разведений, предложен Л. Пастером, был одним из самых первых, который применялся для механического разъединения микроорганизмов. Он заключается в проведении последовательных серийных разведений материала, который содержит микробов, в стерильной жидкой питательной среде. Этот прием достаточно кропотлив и несовершенный в работе, поскольку не позволяет контролировать количество микробных клеток, которые попадают в пробирки при разведениях.

Этого недостатка не имеет метод Коха (метод пластинчатых разведений). Р. Кох использовал плотные питательные среды на основе желатины или агар-агара. Материал с ассоциациями разных видов бактерий разводился в нескольких пробирках с растопленным и кое-что охлажденным желатином, содержание которых позже выливалось на стерильные стеклянные пластины. После застудневания среды оно культивировалось при оптимальной температуре. В его толще образовывались изолированные колонии микроорганизмов, которые легко могут быть перенесены на свежую питательную среду с помощью платиновой петли для получения чистой культуры бактерий.

Метод Дригальского является более совершенным методом, который широко распространен в повседневной микробиологической практике. Сначала на поверхность среды в чашке Петри пипеткой или петлей наносят исследуемый материал. С помощью металлического или стеклянного шпателя его тщательным образом втирают в среду. Чашку во время посева держат привидкритою и осторожно вращают, чтобы равномерно распределить материал. Не стерилизуя шпателя, проводят им занял материалу в другой чашке Петри, при потребности – в третьей. Только после этого шпатель окунают в дезинфикуючий раствор или прожаривают в пламени горелки. На поверхности среды в первой чашке наблюдаем, как правило, сплошной рост бактерий, во второй – густой рост, а в третьей – рост в виде изолированных колоний.

 

 

Колонии по методу Дригальского

 

Метод штриховых посевов сегодня используется в микробиологических лабораториях чаще всего. Материал, который содержит микроорганизмы, набирают бактериологической петлей и наносят на поверхность питательной среды возле края чашки. Снимают избыток материала и проводят занял его параллельными штрихами от края к краю чашки. Спустя сутки инкубации посевов при оптимальной температуре на поверхности чашки вырастают изолированные колонии микробов.

 

Метод штрихов

Для получения изолированных колоний можно использовать занял тампоном, которым проводили забор исследуемого материала. Несколько приоткрываютчашку Петри с питательной средой, вносят туда тампон и осторожными движениями втирают материал в поверхность чашки, возвращая постепенно тампон и чашку.

Таким образом, существенное преимущество методов пластинчатых разведений Коха, Дригальского и штриховых посевов заключается в том, что они создают изолированные колонии микроорганизмов, которые при инокуляции на другую питательную среду превращаются в чистую кул OneRepublic - Counting Stars

1. Достоинства бактериологического метода как «золотого стандарта»: результаты микробиологических исследований позволяют точно установить факт наличия возбудителя в исследуемом материале. Идентификацию чистых культур (до вида микроорганизма) проводят с учётом морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, токситенных и антигенных свойств микроорганизма. Большинство исследований включает определение чувствительности к антимикробным препаратам у выделенного возбудителя.

(другие методы требуют наличие чистой культуры и являются не такими точными)

Ученый : Виноградов

Время: 18 - 24 часа, от скорости размножения культуры

2. так же в 3 этапа (только взятие со строгим сохранением анаэробной среды)

3-й этап - идентификация выделенных облигатных анаэробов. Проводят биохимическую идентификацию в микротест-системе, например АР1-20А. Суспензию выделенной культуры засевают на пластину АР-20А с набором биохимических гестов, инкубируют в анаэробных условиях в течение 48 часов, учитывают биохимические свойства культуры по изменению окраски индикаторов системы и определяют ее родовую и/или видовую принадлежность. Схема выделения чистой культуры облигатных анаэробов.

- Физический метод. Он заключается в удалении воздуха из эксикатора или анаэростата при помощи масля­ного воздушного насоса. Жидкие среды перед засевом для удаления из них воздуха кипятят, то есть проводят так на­зываемое регенерирование среды; для предотвращения кон­такта жидкой среды с воздухом на ее поверхность наносят слой вазелинового или парафинового масла.

- Химический метод. Основан на применении по­глотителей кислорода, например, пирогаллола с гидроокисью натрия, калия либо гидросульфита натрия с гидрокарбонатом натрия в соотношении 1:1.

- Биологический метод (метод Фортнера). Осно­ван на выращивании анаэробов ъ присутствии аэробов (на­пример, «чудесной палочки») в одной чашке Петри. Вначале вырастает аэробная культура, а затем по мере поглощения последней кислорода из чашки начинает развиваться ана­эробная культура.

- Комбинированный метод. Предусматривает ис­пользование двух других, скажем, физического и хими­ческого.

5. 3. Определение понятий: вид, внутривидовые категории (серовар, биовар, фаговар и др.), штамм, клон.

 

внутривидовые категории - группа микроорганизмов одного вида, объединяемых общей антигенной структурой.

ШТАММ – объединяет мкÒ одного и того же вида, но выделенные из опред источника и в опред время.

КЛОН – это культура мкÒ, полученная из единичной клетки, к/я размножилась и дала начало целой популяции.

4. Признаки, лежащие в основе современнои таксономии микроорганизмов.

Микроорганизмы классифицируются на основе морфологических, биохимических, физио- логических (культуральных), серологических и молекулярно-биологических признаков.

 

При описании морфологии бактерий определённого таксона характеризуют следующие присущие ему признаки:

- окраска по Граму,

- форма бактериальной клетки,

- размер бактериальной клетки,

- наличие защитных приспособлений (капсулы, эндоспоры),

- подвижность (наличие жгутиков, их число и расположение),

- расположение бактерий в мазке.

 

Биохим

 

 

культуральные ( жидкие, полужид, плотные)

серологический серогруппы А, В, С, D и Е. (хз)

6. 5. Действие физических и химических факторов на микроорганизмы. Механизмы их повреждающего действия. Стерилизация. Методы стерилизации, аппаратура, режимы стерилизации. Контроль режима стерилизации. Дезинфекция. Основные группы дезинфектантов, область и способ их применения. Асептика, антисептика.

 

Влияние физических факторов.

Влияние температуры. Различные группы микроорганизмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) — мезофилами, при высокой — термофилами.

К психрофильным микроорганизмам относится большая группа сапрофитов — обитателей почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, светящиеся бактерии, бациллы). Некоторые из них могут вызывать порчу продуктов питания на холоде. Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бактерии (возбудитель псевдотуберкулеза размножается при температуре 4 °С). В зависимости от температуры культивирования свойства бактерий меняются. Интервал температур, при котором возможен рост психрофильных бактерий, колеблется от -10 до 40 °С, а температурный оптимум — от 15 до 40 °С, приближаясь к температурному оптимуму мезофильных бактерий.

Мезофилы включают основную группу патогенных и условно-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10— 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С.

При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развиваются термофильные бактерии. На дне океана в горячих сульфидных водах живут бактерии, развивающиеся при температуре 250—300 °С и давлении 262 атм.

Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности навозом и компостом. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассматривают как показатель загрязненности почвы.

Хорошо выдерживают микроорганизмы действие низких температур. Поэтому их можно долго хранить в замороженном состоянии, в том числе при температуре жидкого газа (—173 °С).

Высушивание. Обезвоживание вызывает нарушение функций большинства микроорганизмов. Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гонореи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные слизью мокроты.

Высушивание под вакуумом из замороженного состояния — лиофилизацию — используют для продления жизнеспособности, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные культуры микроорганизмов и иммунобиологические препараты длительно (в течение нескольких лет) сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств.

Действие излучения. Неионизирующее излучение — ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение — гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предметов в больницах, родильных домах, микробиологических лабораториях. С этой целью используют бактерицидные лампы УФ-излучения с длиной волны 200—450 нм.

Ионизирующее излучение применяют для стерилизации одноразовой пластиковой микробиологической посуды, питательных сред, перевязочных материалов, лекарственных препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию ионизирующих излучений, например Micrococcus radiodurans была выделена из ядерного реактора.

Действие химических веществ. Химические вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост. Химические вещества, уничтожающие микроорганизмы в окружающей среде, называются дезинфицирующими. Антимикробные химические вещества могут обладать бактерицидным, вирулицидным, фунгицидным действием и т.д.

Химические вещества, используемые для дезинфекции, относятся к различным группам, среди которых наиболее широко представлены вещества, относящиеся к хлор-, йод- и бромсодержащим соединениям и окислителям.

Антимикробным действием обладают также кислоты и их соли (оксолиновая, салициловая, борная); щелочи (аммиак и его соли).

.

Дезинфекция — процедура, предусматривающая обработку загрязненного микробами предмета с целью их уничтожения до такой степени, чтобы они не смогли вызвать инфекцию при использовании данного предмета. Как правило, при дезинфекции погибает большая часть микробов (в том числе все патогенные), однако споры и некоторые резистентные вирусы могут остаться в жизнеспособном состоянии.

Асептика – комплекс мер, направленных на предупреждение попадания возбудителя инфекции в рану, органы больного при операциях, лечебных и диагностических процедурах. Методы асептики применяют для борьбы с экзогенной инфекцией, источниками которой являются больные и бактерионосители.

Антисептика – совокупность мер, направленных на уничтожение микробов в ране, патологическом очаге или организме в целом, на предупреждение или ликвидацию воспалительного процесса.

 

Стерилизация (иногда деконтаминация) — освобождение какого-либо предмета или материала от всех видов микроорганизмов (включая бактерии и их споры, грибы, вирусы и прионы), либо их уничтожение. Осуществляется термическим, химическим, радиационным, фильтрационным методами.

Методы стерилизации

• Термическая: паровая и воздушная (сухожаровая)

• Химическая: газовая или химическими растворами (стерилянтами)

• Плазменная (плазмой перекиси водорода)

• Радиационная стерилизация — применяется в промышленном варианте

• Метод мембранных фильтров — применяется для получения небольшого количества стерильных растворов, качество которых может резко ухудшиться при действии других методов стерилизации(бактериофаг, селективные питательные среды, антибиотики)