ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ

ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ

Физиологию, биохимические свойства и циклы развития микроорганизмов исследуют, как правило, при работе с чистыми культурами. Чистой, или аксенической, называют культуру, содержащую микроорганизмы одного вида. Уме­ние выделить микроорганизмы одного вида из смешанной популяции, суще­ствующей в природе, и поддерживать чистоту культуры — необходимые усло­вия работы с микроорганизмами. Выделение чистой культуры обычно включа­ет три этапа: 1) получение накопительной культуры; 2) выделение чистой куль­туры; 3) определение чистоты выделенной культуры.

ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ

Накопительной называют такую культуру, в которой преобладают предста­вители одной физиологической группы или даже одного вида микроорганиз­мов. Метод накопительных культур был введен в практику микробиологиче­ских исследований С.Н. Виноградским и М. Бейеринком. Сущность его заклю­чается в создании элективных, т.е. избирательных, условий, которые обеспе­чивают преимущественное развитие желаемых (необходимых исследователю) микроорганизмов или группы микроорганизмов из смешанной популяции.

При создании элективных условий необходимо знать физиологию или четко представлять те особенности, которыми должны обладать выделяемые микроорганизмы. Элективные условия создают чаще всего подбором соответствующих сред, поскольку различные микроорганизмы для своего развития предъяв­ляют неодинаковые требования к источникам питания. Например, микроорга­низмы, способные фиксировать молекулярный азот, могут расти в среде, из состава которой исключены связанные формы азота. Если внести в такую среду почву, то из громадного разнообразия имеющихся в ней микроорганизмов в первую очередь будут развиваться азотфиксаторы. Накопительные культуры автотрофных микроорганизмов получают на средах, где единственным источни­ком углерода служит углекислота. Отсутствие в среде других соединений углеро­да задерживает развитие гетеротрофов. Такие специфические питательные среды, удовлетворяющие потребности преимущественно одной группы микроор­ганизмов, носят название элективных. В зарубежной литературе большее распро­странение получили термины «накопительные», или «селективные», среды.

Иногда при выделении микроорганизмов из природных популяций в среду включают антибиотики, которые отличаются специфичностью действия и по­зволяют избирательно подавлять рост определенной группы микроорганизмов. Так, элективные условия для развития грамотрицательных бактерий можно создавать внесением в среду пенициллина в концентрации от 0,2 до 100 мг/л, Поскольку многие виды грамположительных бактерий при этом или совсем не развиваются, или развиваются медленно. Чтобы создать благоприятные усло­вия для развития бактерий и, напротив, подавить рост мицелиальных грибов, к средам рекомендуют добавлять нистатин в концентрации от 0,1 до 20 мг/л или гризеофульвин в концентрации от 1 до 20 мг/л.

Рис. 6.1. Основные факторы, определяющие получение накопительных культур некоторых групп бактерий (по Р. Стейниеру и др., 1979)

При создании элективных условий следует учитывать неодинаковое отношение различных микроорганизмов к аэрации, температуре, кислотности среды, освещению и т. д. Поэтому при получении накопительной культуры аэробных микроорганизмов обеспечивают большую поверхность контакта питатель­ной среды с воздухом, а для обогащения среды анаэробными микроорганиз­мами тем или иным способом создают анаэробные условия. Культивирование при высокой температуре (50°С и выше) исключает развитие мезофильных микроорганизмов и обеспечивает рост термофилов. Селективным фактором может служить также неодинаковая скорость роста различных микроорганиз­мов при данной температуре. Например, в ряде случаев из-за различий в опти­мальных температурах роста на минеральной среде при освещении и темпера­туре 35 °С удается почти полностью подавить рост зеленых водорослей и полу­чить культуру, обогащенную цианобактериями.

При получении накопительных культур следует учитывать и такую особен­ность микроорганизмов, как способность к образованию эндоспор. Для накоп­ления спорообразующих бактерий среды инокулируют, как правило, субстра­том, который предварительно пастеризуют, т.е. кратковременно прогревают при высокой температуре (10 мин при 75°С или 2 — 5 мин при 80 °С). Таким образом можно полностью или почти полностью исключить развитие бакте­рий, не образующих споры.

Следует иметь в виду, что элективные условия далеко не всегда оптималь­ны для роста выделяемых микроорганизмов, однако они переносятся ими луч­ше, чем сопутствующими формами.

О развитии накопительной культуры судят по появлению характерных при­знаков роста выделяемых микроорганизмов — помутнению среды, иногда со­провождаемому пигментацией, появлению пленки, осадка, выделению газов. Помимо визуального наблюдения накопительную культуру микроскопируют и выявляют присутствие желаемых форм. Иногда необходимо определить про­дукты метаболизма, образование которых свойственно выделяемым микроор­ганизмам. Например, о развитии нитрифицирующих бактерий свидетельствует появление в среде нитрит- и нитрат-ионов и уменьшение или даже полное исчезновение иона аммония.

Основные условия элективности, позволяющие получить накопительные культуры микроорганизмов с различным типом обмена веществ, см. на рис. 6.1.

ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ

После того как получена накопительная культура, приступают к выделе­нию чистой культуры. Она может быть получена из отдельной колонии или одной клетки.