При анализе четвертой пробирке Вы оптимизируете настройки ТОЛЬКО по каналу FL4. Настройки остальных каналов Вы НЕ ИЗМЕНЯЕТЕ !!!

 

 

Итак, Вы настроили четыре канала флуоресценции по соответствующим изотипическим контролям. После завершения сбора данных по четвертой пробирке, где у Вас находился изотипический контроля по FL4. По завершении настройки этой пробирки все изменения в проколе необходимо сохранить. Для этого левой клавишей мыши следует нажать на клавишу “Save Protocol” в левой верхней части экрана.

 

Как только прибор перешел к анализу пятой пробирке, в которой у Вас находятся частицы Flow-Set Pro, то Вам необходимо:

1. создать две однопараметрические гистограммы – по FS и SS, как это Вы делали при создании протокола (гистограммы не стоит гейтировать, сверху в них должно быть написано “Ungated”);

2. понизить дискриминатор (графа “Discr.” напротив “FS” в онке “Cytometer Control”) до 30 единиц по FS (флуоросферы Flow-Set Pro имеют очень небольшой размер);

3. не ставя галочки напротив “Setup Mode” в окне “Cytometer Control” проанализировать 10000 событий и нажать клавишу “Stop”

4. Если Вы правильно понизили дискриминатор, то в самом начале координат на однопараметрической гистограмме по FS Вы увидите очень узкий пик частиц почти в самом начале координат (на гистограммах по FL1, FL2, FL3 и FL4 Вы не увидите событий, так как на них отображаются событий из области “A”, в которую из-за небольшого размера флуоросферы Flow-Set Pro не попадают!). Ваше рабочее пространство имеет следующий вид:

 

5. Теперь Вам необходимо создать новый линейный регион (в нашем случае регион “F”) на однопараметрической гистограмме по FS, как это Вы делали при создании регионов для настройки протокола по изотипическим контролям, и зайти в свойства этой гистограммы. При этом пик частиц необходимо охватить очень плотно, чтобы дуплеты (следующий маленький пик) не попадали в данную область. Чтобы уменьшить число дуплетов перед началом работы флакон с флуоросферами Flow-Set Pro необходимо тщательно перемешать!!!

Для этого нажатием правой кнопки мыши на гистограмме вызовите диалоговое окно (действие 1), в котором нажатием левой кнопки мыши выберите раздел “Format Plot” (действие 2).

 

 

 

 

После выбора раздела “Format Plot” у Вас появится окно “Histogram Plot Properties”.

 

В графе “Gate”, нажав левой кнопкой мыши по указанному на рисунке месту (действие 1), и выберите из списка доступных регионов регион “F” (или тот регион, в который у Вас попадает пик частиц Flow-Set Pro по гистограмме FS) и нажмите на его названии левой клавишей мыши (действие 2).

 

 

Тем самым, на данной гистограмме у Вас буду отображаться события, попадающие только в регион “F”, однако этот регион можно применить и ко всем остальным гистограммам, так как в данном случае Вас интересует только флуоресценция этих частиц и ничего более. Для этого Вам необходимо поставить галочку напротив графы “Apply gate to all plots” нажатием левой клавиши мыши , как это показано на рисунке.

 

… и нажать клавишу .

 

После этого на всех гистограммах Вашего протокола будут отображать только значения, полученные для флуоросфер Flow-Set Pro (в данном случае – частицы выделены синим цветом на всех гистограммах).

 

 

Величина, необходимая Вам для дальнейшей настройки протокола – это “X-mean” или средняя интенсивность флуоресценции. В данном случае Вам необходимо «перевести» язык изотипических контролей (их среднюю флуоресценцию – собственно, то ради чего Вы и настраивали изотипические контроли – чтобы знать фон или флуоресценцию негативных – неокрашенных специфическими антителами – клеток) на язык, понятный прибору, то есть на среднюю флуоресценцию флуоросфер Flow-Set Pro при ВАШИХ НАСТРОЙКАХ НАПРЯЖЕНИЯ!!! Эти величины необходимо записать для всех настроенных Вами каналов, то есть прямого (FS) и бокового (SS) светорассеяния, а также каналов флуоресценции - по FL1, FL2, FL3 и FL4. Как это сделать?

Для начало необходимо войти в окно статистики - кнопка “Select Result” – и нажать на нее левой клавишей мыши .

 

 

После этого у Вас появится окно, где в разделе “Statistic Type” синим отмечены статистические данные, которые прибор выдает «по умолчанию» для проанализированных событий. В данном случае Вас интересует только “X-Mean”, а все остальные графы можно инактивировать нажатием левой клавиши мыши , как это показано на рисунке.

 

 

 

После этих манипуляций подсвеченной синим у Вас должна остаться только строчка “X-Mean”. По завершении – нажмите клавишу .

 

Теперь Вам необходимо записать значения X-MeanпоFS, SS, FL1, FL2, FL3 и FL4 на листок бумаги. Для этого Вам необходимо открыть раздел статистики на всех однопараметрических гистограммах. Наведите курсор мыши на нижний левый угол для начала гистограммы FL1, курсор мыши приобретет у Вас вид , и нажмите левую клавишу мыши , как это показано на рисунке. И у Вас под гистограммой появится окошко со статистикой.

 

Проделайте эту манипуляцию со всеми остальными однопараметрическими гистограммами, у Вас окно должно приобрести следующий вид:

 

Теперь запишите значения X-Mean на листок бумаги. В приведенном случае эти величины составили:

Параметр	Значение X-Mean
FS	58,8
SS
FL1	37,7
FL2
FL3
FL4	48,4

 

Эти значения Вам понадобятся при создании панели автонастройки компенсации прибора.

Теперь можно перейти к созданию панели автонастройки.