Тема №5. Питательные среды и приготовление их.

Цель занятия: изучить состав питательных сред, их классификацию, приготовление.

Материалы: чашки Петри, пробирки, колбы, питательные среды.

Питательная среда — вещество или смесь веществ, применяемая для культивирования макро- и микроорганизмов. В состав, применяемых для выращивания бактерий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы: фосфор, калий, серу, натрий, железо; микроэлементы - кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден и др. Данные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении. Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинаково и этим исключается возможность создания универсальной среды.

Требования, предъявляемые к питательным средам.

1. содержание необходимых для питания микроба питательные вещества

2. иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба

3. иметь достаточную влажность, т.к. микробы питаются по законам диффузии и осмоса

4. быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур.

Существует множество стандартных биологических питательных сред.

По предназначению подразделяют на:

· Обычные (Мясо-пептонный агар или МПА, Мясо-пептонный бульон или МПБ)

· Консервирующие (Транспортные)

· Специальные

Элективные

Среды обогащения

· Дифференциально-диагностические

· Среды для хранения культур

По составу: простые (МПА, МПБ) и сложные

По происхождению: естественные (МПА, МПБ, картофель) используется для накопления биомассы для изготовления биопрепаратов: вакцин, антигенов; искусственные или синтетические) (среда Сабуро) для изучения обмена веществ микроорганизмов, роста небольшого числа патогенных бактерий

По консистенции: жидкие, полужидкие, плотные (готовят из жидких посредством добавления к ним клеевых веществ: агара или желатины), сухие

По степени аэрации среды: аэробные и анаэробные (общие и дифференциально-диагностические)

Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные. Среды общего назначения используют для выращивания многих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя кровь, сахар, молоко и другие ингредиенты. Специальные среды характеризуются добавлением специфического компонента или заменой основы (сывороточный агар, кровяной бульон). К ним относятся элективные (желточно-солевой агар (ЖСА) — для стафилококка, среда Мюллера — для сальмонелл, селенитовая среда — для сальмонелл) и дифференциально-диагностические (среды Гисса («пёстрый ряд»), среда Сабуро — с добавлением антибиотика), среды обогащения (среда Петраньяни).

Принцип элективных сред основан на обеспечении развития одного вида или группы микроорганизмов при оптимальных условиях или подавлении роста других микроорганизмов.

Дифференциально-диагностические среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ.

По своему назначению дифференциально-диагностические среды разделяются на 4 группы: 1) среды для выявления протеолитической и гемолитической способности, содержащие в себе белковые вещества-кровь, молоко, желатину и т.д.

2) среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами.

3) среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов.

4) среды для определения редуцирующей способности микробов

Сухие питательные среды. Приготовление сред один из наиболее важных моментов работы бактериологической лаборатории. Сухие питательные среды представляют собой гигроскопические порошки, растворяющиеся в воде. Наряду с обычной средой, МПА, производится много специальных питательных сред сложного рецептурного состава для выращивания микробов кишечной группы (например, Среды Эндо, Левина, сухой бактора-агар Плоскирева).

Консервированные питательные среды поступают в продажу в стеклянных банках с плотно завинчивающимися крышками, обеспечивающие герметичность.

Приготовление основных питательных сред

МПБ - Готовят на мясной воде, используя свежее мясо-говядину, телятину, конину, которую предварительно освобождают от жира, сухожилий и прокручивают на мясорубке; 500,0 фарша заливают 1 л водопроводной воды, настаивают 16-24 ч в прохладном месте (4-6°С). Мясной настой сливают, отжимая мясо, кипятят на слабом огне и фильтруют через бумажный фильтр. Прозрачную, соломенно-желтого цвета жидкость сливают в измерительный цилиндр, доливают водопроводной водой до исходного объема. Полученную воду стерилизуют в бутылях, закрытых ватно-марлевыми пробками, 20 минут при 120°С или дробно текучим паром. Стерильная мясная вода может длительно храниться. МПБ готовят на мясной воде, добавив к 1 л воды 10,0 пептона, 5,0 NaCl и кипятят 10-15 мин на слабом огне при постоянном помешивании. После остывания устанавливают рН 7,0-7,2. Затем бульон фильтруют, разливают в колбы или пробирки, стерилизуют 20 мин при 120°С.

МПА - К 1л МПБ прибавляют 15,0-25,0 мелко нарезанного хорошо промытого агар-агара и постоянно помешивая на слабом огне, доводят до кипения (при этом агар должен раствориться) Устанавливают нужное значение рН (обычно 7,0-7,2). В случае помутнения среды ее просветляют белком, фильтруют, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют в автоклаве 15-20 мин при 120°С.

МПЖ - К МПБ добавляют 10-15% (в теплое время года концентрацию увеличивают) мелко нарезанной желатины и растворяют, нагревая на водяной бане, при 40-50°С. Устанавливают рН (7,0-7,4). Растопленную желатину фильтруют через бумажный фильтр (желатина фильтруется медленно). Профильтрованную среду разливают в пробирки так, чтобы не запачкать края изнутри. Разлитую по пробиркам среду стерилизуют дробно 3 дня по 1 часу при 100°С. При сильном перегревании желатина теряет способность застывать.