Тема №9. Заражение лабораторных животных. Определение патогенности микроорганизмов

Цель занятия: изучить различные способы заражения лабораторных животных.

Материалы и оборудование: лабораторные животные, скарификаторы, иглы, трепан, скальпель, жесткие щетки, ножницы, кюветы.

В диагностической работе бактериологических лабораторий часто приходится прибегать к заражению так называемых лабораторных, или опытных, животных. Чаще всего применяют для этой цели мелких животных: белых мышей и крыс, морских свинок, кроликов, а из птиц-голубей и кур. Реже собак и кошек, сельскохозяйственных животных.

Цель биологических методов исследования заключается в определении патогенности или степени вирулентности исследуемого материала, выделении из материала чистых культур микробов и т. д. Кроме того, лабораторные животные используются при определении качеств биологических и химиотерапевтических препаратов, а также научно-экспериментальной работе, для диагностики некоторых инфекционных заболеваний, моделирования экспериментальных острых и хронических инфекционных процессов, установления вирулентности и токсигенности изучаемых штаммов микробов, определения активности приготовленных вакцин и исследования их на безвредность. Токсигенность микроба измеряют в специальных условных единицах: абсолютная летальная доза (DcL dosis certae letalis) вызывает гибель 100% зараженных животных; максимальная летальная доза (Dim dosis letalis maxima) гибель 95% зараженных; 50%-ная летальная доза (LD50); 50%-ная инфицирующая доза (ID50). LD50 и ID50 являются точными показателями, отражающие чувствительность к возбудителю, а LD и Dim показывают чувствительность наиболее устойчивых особей.

Методика определения DcL и LD50. Стерильным физраствором смывают суточную агаровую культуру P.multocida ( E. сoli), взвесь бактерий пипеткой переносят в стерильную пробирку , добавляя в нее физраствор, чтобы довести концентрацию бактерий до 1 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности. Затем из этой взвеси готовят последовательные двукратные разведения на стерильном физрастворе. 500млн, 250, 125 и т.д., в зависимости от предполагаемой вирулентности микроорганизма. Взвесь 0,5 мл вводят внутрибрюшинно или подкожно 3 мышам. Животных метим краской и в течение 10 дней наблюдаем за их состоянием, отмечая количество павших. Результаты заносят в таблицу.

Методы заражения животных. Для опытов берут одного возраста и веса, биркуют или метят. Для удобства фиксируют.

Скарификация. Скальпелем делают небольшие надрезы кожи (насечки) после чего в них втирают жесткой щеткой исследуемый материал или бактериальную культуру. Шерсть на месте заражения предварительно выстригают и дезинфицируют.

Внутрикожный способ заражения. При этом способе применяют тонкие острые иглы с небольшим скосом. Кожу в месте введения материала растягивают, вводят иглу под очень острым углом, почти касаясь кожи. Конец иглы должен быть виден. При введении материала эпидермис приподнимается в виде четко ограниченного бугорка, кожа над ним становится прозрачной и пористой, вследствие чего ее сравнивают иногда с лимонной корочкой. Материал вводят в объеме до 0,1 мл обычно в кожу спины или живота.

Подкожный способ заражения. Кожу в месте введения материала берут у ее основания. Иглу шприца вкалывают снизу образовавшейся складки. Проколов кожу и пройдя вглубь на несколько миллиметров, иглу отклоняют вправо или влево и затем медленно вводят материал, содержащийся в шприце. Изменять направление иглы под кожей рекомендуется для того, чтобы введенное вещество не выступало через прокол кожи наружу. Затем складку кожи опускают, на место укола накладывают ватный тампон, смоченный спиртом или спиртовым раствором, а иглу быстро вынимают. Наиболее удобными местами для подкожного введения материала у кроликов и морских свинок являются область спины и боковые поверхности несколько ниже подмышечных впадин, у крыс и мышей— область спины, крестца и затылка. Количество жидкости, вводимой подкожно, не должно превышать 30 мл для кроликов, 15 мл—для морских свинок, 10 мл-—для крыс и 1 мл — для мышей.

Внутримышечный способ заражения. Выбирают участок тела с наиболее развитым мышечным слоем. У кроликов, морских свинок, крыс и мышей таким местом является наружная верхняя треть бедра задней лапы. Вводят иглу почти под прямым углом вглубь мышц. Объем жидкости, допустимый для внутримышечного введения, составляет для кроликов 8 мл, для морских свинок — 5 мл, для крыс — 3 мл, для мышей — 0,5 мл.

Внутрибрюшинный способ заражения. Держат животное вниз головой. В этом положении кишечник смещается в сторону диафрагмы, что в значительной мере уменьшает возможность его повреждения в момент прокола. У животных (за исключением мышей) в нижней трети живота, несколько отступя от средней линии, делают скальпелем или остроконечными ножницами надсечку кожи длиной 2—3 мм и через ее вводят притуплённую иглу, держа шприц перпендикулярно к брюшной стенке. Внутрибрюшинно можно вводить до 30 мл жидкости кроликам, до 10 мл — морским свинкам, до 5 мл — крысам, до 2 мл — мышам.

Внутривенное заражение кроликов. Кроликов заражают в краевую вену уха. Вдоль наружного края уха выщипывают шерсть, затем это место слегка пощелкивают кончиками пальцев, чтобы вызвать гиперемию сосудов, и протирают ватой, смоченной в 70% спирте.

Чтобы удостовериться, правильно ли введена игла, вводят сначала небольшое количество материала. При нахождении иглы в полости вены материал вводится свободно, в противном же случае жидкость из шприца вытекает с трудом, а на ухе в месте введения образуется вздутие. Если игла не попала в вену, ее вынимают и вводят повторно в другое место, ближе к основанию уха. По окончании введения нижний участок вены слегка придавливают, а к месту укола прикладывают кусочек стерильной ваты, смоченной спиртом или спиртовым раствором йода, после чего из вены извлекают иглу. Внутривенно кроликам можно вводить до 20 мл жидкости.

Внутривенное заражение крыс и мышей. Крыс и мышей заражают в боковую вену хвоста. Непосредственно перед введением материала хвост животного, чтобы вызвать гиперемию сосудов, погружают в сосуд с водой, подогретой до 50 °С, смазывают ксилолом или толуолом. После того как сосуды заметно набухают, корень хвоста сдавливают пальцами. Взрослым белым крысам допускается вводить до 6 мл жидкости, мышам— до 0,5 мл.

Заражение через пищеварительный тракт. Заразить животное через рот можно двумя способами. Материал, предназначенный для заражения, примешивают к корму или питью животного.

Такой способ является наиболее простым и естественным, однако в лабораторной практике применение его ограничено, поскольку количество материала, попадающее в организм заражаемого животного, не подлежит точному учету. Поэтому значительно чаще материал, предназначенный для заражения, вводят животному шприцем, игла которого имеет незначительный изгиб и утолщение на конце в виде оливы. Наличие изгиба допускает введение иглы в пищевод животного.

Интрацеребральное заражение. Применяется чаще у кроликов, крыс и мышей. Трепанируют область между надбровными буграми и черепным гребнем. Трепаном выпиливают диск, производят заражение, закрывают тампоном и заливают коллодием.

Доза вводимого материала-0,2-0,3 мл. При отсутствии инструментов для трепанации можно произвести заражение в мозг путем прокола черепа через кожу, иглой шприца, несколько сбоку от средней линии в области затылочного бугра.

Бактериологическое исследование трупа. Проводят с целью выделения чистой культуры микроба при диагностических исследованиях либо для подтверждения специфической природы гибели животного при заражении чистой культурой. Трупы вскрывают по правилам асептики. Тело фиксируют в спинном положении на доске или кювете. Кожно-шерстный покров дезинфицируют 5% раствором фенола или лизола. Разрез по белой линии от промежности до грудинно-ключичного сочленения. Кожу отделяют от мышц, делают поперечные надрезы и отводят кожные лоскуты в стороны. Ножницами рассекают ребра, грудину откидывают кверху. Первоначально вскрывают грудную полость. Учет ведет в патологоанатомическом журнале. Поверхность сердца, легких, лимфоузлов прижигают раскаленным шпателем, пастеровской пипеткой прокалывают и насасывают небольшое количество крови (тканевой пульпы) и высевают на питательные среды, соблюдая стерильность. Затем вскрывают брюшную полость. Оттягивают вверх и разрезают от диафрагмы до анального отверстия. Осмотр. Прижигают и делают посевы с печени, почек, селезенки, лимфоузлов, в случае необходимости-кишечника. Параллельно делают мазки-отпечатки для микроскопии. Всю работу с трупами проводят, соблюдая меры, предупреждающие распространение возбудителя. После окончания все дезинфицируют. Трупы животных и отдельные органы обезвреживают автоклавированием или сжигают в трупосжигательной печи.

Тема №10. Бактериофаги (биологические факторы)

Цель занятия. Усвоить методику титрования бактериофагов (определение их активности), практическое использование фага, диагностическое значение реакции нарастания титра фага.

Материалы и оборудование. Пробирки с фагом, пробирки с гомологичной фагу бактериальной культурой (вакцинный штамм В. anthracis или другие фаги и культуры), чистые сухие пробирки, градуированные пипетки, пастеровские пипетки, стерильные чашки Петри с МПА, смесь бактериальной культуры с фагом, фильтры Зейтца (стерильные). Таблицы — морфология фага, колония фага на пластинчатом агаре (стерильные пятна).

Бактериофаги (фаги) характеризуются главным образом своим литическим действием на гомологичные им виды бактерий. Это явление называется Бактериофагией (греч. phagein — пожирать). Фаги — вирусы определенной, формы и структуры. О присутствии фага судят по его специфическому действию на соответствующий вид бактерий. Название фага происходит от названия вида микроба, лизируемого данным фагом (коли-фаг, суипести-фер-фаг, сибиреязвенный гамма-фаг и др.). Хотя фаги отличаются специфичностью по отношению к гомологичному виду микроба, но действуют также и на группу родственных видов бактерий. Фаги обладают антигенными свойствами, их используют для гипериммунизации животных с целью получения антифаговых диагностических сывороток. Лизирующее действие фага внешне выражается полным просветлением бульонных культур и образованием прозрачных участков среди сплошного роста бактерий на засеянной поверхности плотной среды (стерильные пятна).

Методика обнаружения фага. 1. В две пробирки с жидкой средой засевают гомологичную фагу бактериальную культуру. В одну из пробирок пастеровской пипеткой вносят каплю фага. Обе пробирки помещают в термостат. Через 16-18 ч в пробирке, где находился фаг, вследствие лизисабактерий под его влиянием бульон просветляется. В другой пробирке (без фага) наблюдается обильный рост засеянной культуры.

Обе засеянные пробирки ставят в термостат, через 4— 6 ч роста культуры при четко выраженном помутнении среды в одну из пробирок вносят каплю специфического фага и обе пробирки вновь ставят в термостат и учитывают результат через 16-18 ч (после первоначального посева). В пробирке с фагом среда просветляется, а без фага — она становится еще более мутной (обильный рост культуры).

Для выявления действия фага на плотной среде бульонную культуру высевают на агар в чашках Петри: 1 каплю культуры растирают стеклянным шпателем по всей поверхности агара, крышку закрывают, чашки помещают в термостат на 3—4 ч. Затем в одну чашку на агаре с молодой культурой вносят фаг по одной капле в нескольких местах и вновь чашки ставят в термостат на сутки. По истечении этого времени в контрольной чашке (без фага) обычно наблюдается обильный сплошной рост бактерий по всей поверхности среды; в чашке с добавленным фагом наблюдается задержка роста бактерий в местах нахождения капель с фагом.

Фаг используют: 1) для фагодиагностики возбудителей сибирской язвы, сальмонеллеза и некоторых других (путем обнаружения специфического фага в исследуемом материале и воздействием специфического фага на бактериальную культуру, выделенную из исследуемого материала); 2) для лечения и профилактики инфекционных болезней (сальмонеллез, колибактериоз).

Для практических целей фаги серийно производят на биофабриках. Каждая серия фага перед ее выпуском проверяется на активность, то есть проверяют титр фага — его наименьшая концентрация (или наибольшая степень разведения), которая способна лизировать гомологичную культуру. Чем выше степень разведения, тем активнее фаг. Титрование фага осуществляют как в жидких, так и на плотных средах.

Методика титрования фага. В пробирки разливают МПБ (по 4,5 мл в каждую), затем в первую пробирку вносят 0,5 мл исследуемого фага, перемешивают и делают последовательные разведения — из первой пробирки во вторую (по 0,5 мл), из второй переносят в третью и т. д., уменьшая концентрацию (в каждой пробирке) в 10 раз. В пробирки с разведенным фагом вносят по 1 капле суточной культуры соответствующих бактерий, встряхивают, лизисе пробирки ставят в термостат на сутки, затем учитывают результат — титр. Фаг считается достаточно активным, если он лизирует в разведениях 10^-5—10^-8

При титрации фага на плотной среде чашки Петри с МПА засевают культурой по всей поверхности агара и разделяют на сектора, в каждый сектор вносят по капле фага различной концентрации, ставят в термостат. Результат учитывают через сутки