Тема №13. Реакция преципитации и ее модификации.

Цель занятия: изучить серологические реакции (реакцию преципитации), технику выполнения и учет результатов

Материалы и оборудование: сыворотка крови, штатив с пробирками, спица, молоко, предметные стекла.

Основана на том, что при соединении антигена со специфическими антителами, находящиеся в сыворотке образуется осадок – преципитат. Постановка осуществляется в пробирках в жидкой питательной среде и в чашках Петри в плотной агаровой среде (диффузная преципитация). Хотя существует метод постановки РП путем смешивания антигена с сывороткой в пробирках, но распространенным

Реакция кольцепреципитации по Асколи Специфическая преципитирующая сыворотка биофабричного выпуска не нужна, антигеном РП служит фильтрат живой или убитой нагреванием микробной культуры или экстракт из исследуемого материала. Экстрагирование производят кипячением или длительным воздействием физраствора при комнатной температуре, после чего экстракт фильтруют до прозрачности. Постановка метода: в узкие пробирки Уленгута (диаметр 4 мм) тонкой пастеровской пипеткой разливают одинаковое количество специфической преципитирующей сыворотки (изготовляемой биофабрикой) по 0,3—-0,4 мл и антигена. Технику постановки реакции осуществляют либо наслаиванием антигена на сыворотку, либо подслаиванием сыворотки под антиген (чтобы не произошло смешивания, так как сыворотка тяжелее антигена). Если в пробирки сначала разлита сыворотка, фильтрат экстракта (другой пипеткой) осторожно наслаивают по стенке пробирки, не касаясь сыворотки. Пробирку полагается держать вертикально. Если же в пробирку предварительно разлили антиген, то другой пипеткой сыворотку подслаивают под антиген, пипетку вводят осторожно (чтобы ни одна капля не упала) до дна пробирки, также осторожно приподнимают палец правой руки, закрывавший верхнее отверстие пипетки, затем пипетку вынимают, не взбалтывая жидкости. При подслаивании или наслаивании, в случаях положительного результата, на границе двух жидкостей почти сразу или в течение 1—2 мин образуется резко отграниченное кольцо (смотреть сбоку) или диск — преципитат. Специфичность реакции проверяют контролями сыворотки и антигена. Контроль сыворотки: на иммунную сыворотку в отдельных пробирках наслаивают в одну пробирку 0, 1 мл физраствора, в другую — 0,1 мл стерильной среды, на которой готовился антиген, в третьей пробирке — к 0,1 мл сыворотки +0,1 мл гетерогенного антигена. Для контроля антигена в отдельные 2—3 пробирки разливают нормальную сыворотку того же вида животного (не гипериммунизированного), от которого получена преципитирующая сыворотка, сверху добавляют по 0,1 мл антигена, оставляют при комнатной температуре и учитывают через 1—2 мин. Реакция считается положительной: 1) если диск (кольцо) преципитата появляется вскоре после наслаивания антигена (или подслаивания сыворотки) через несколько минут (не позже 1—2); 2) если в контрольных пробирках реакция отрицательная — нет преципитата (диска-кольца). При постановке РП соблюдают определенные условия, нарушение которых ведет к неправильным (ложным) результатам.

При исследовании единичных проб материала (мяса, патологического материала) и необходимости срочного ответа для получения антигена применяют экстрагирование кипячением. При массовом исследовании проб материала (большое количество проб кожевенного сырья) обычно пользуются длительным (холодным способом) экстрагированием физиологическим раствором NaCl при комнатной температуре (18—24 ч). Все поступившие в лабораторию пробы предварительно обеззараживают автоклавированием, а затем эти пробы измельчают и экстрагируют в небольших (аптечных) склянках. Экстракт, полученный кипячением или длительным (холодным) способом, фильтруют через асбестовую вату до полной прозрачности полученный антиген (экстракт) исследуют в РП.

Реакция диффузионной преципитации в агаровом геле на предметном стекле считается быстрой и ориентировочной. Ставят диффузионную преципитацию в агаровом геле в чашках Петри: в стерильные чашки Петри с ровным дном наливают тонким слоем 1 %-ный расплавленный агар (с мертиолатом), распределяют тонким слоем по всей поверхности дна чашки — этим создается предохранительный слой, препятствующий подтеканию компонентов реакции под слой геля, в котором происходит преципитация. Когда слой агара застынет, на его поверхности расставляют металлические (фарфоровые) цилиндрики 5-—8 мм в диаметре и наливают слой агара. Когда агар застынет, цилиндрики осторожно вынимают пинцетом за верхний край, образуются лунки с ровными краями. Расстояние между лунками 15 мм. Если исследуют несколько антигенов, одну лунку образуют в центре и в нее вносят специфическую преципитирующую сыворотку, а вокруг — лунки с разными антигенами (экстракты исследуемого материала), чашки помещают в эксикатор и термостат. Реакцию учитывают через сутки. Положительным качеством метода РП в агаровом геле является возможность ее использования для реакции с относительно мутными антигенами, а также простота техники. Недостатки этих методик — длительность реакции, несовершенство количественного анализа (особенно при исследовании токсинов) и слабая чувствительность в отношении некоторых бактерийных токсинов.