Тема №15. Метод флуоресцирующих антител (МФА). Реакция нейтрализации (РН).

Цель занятия: изучить серологические реакции (реакцию нейтрализации), метод флуоресцирующих антител, технику выполнения и учет результатов

Материалы и оборудование: сыворотка крови, штатив с пробирками, фиксаторы.

Метод флуоресцирующих антител (МФА).

Возможности данного метода обусловлены специфичностью первой фазы серологических реакций с высокой чувствительностью люминесцентного анализа. Для осуществления МФА необходимо иметь высокоспецифические иммунные люминесцирующие сыворотки. Известно, что в различных серологических реакциях, используемых в микробиологической практике, участвуют преимущественно три компонента: бактерийный антиген, антитело и комплемент. Все три компонента, по сути, являются антигенами, и против каждого из них могут быть получены иммунные сыворотки и, соответственно, люминесцирующие антитела. В зависимости от того, какого типа люминесцирующую сыворотку используют (против бактерийного антигена, антибактериальных антител, комплемента), различают три основных варианта метода флуоресцирующих антител: прямой (1) и непрямой (2) варианты и модификация непрямого варианта с использованием комплемента. Иммунологическая реакция между антигеном и антителом осуществляется в этих модификациях непосредственно на предметном стекле. Для фиксации микроорганизмов применяют органические растворители: ацетон, этанол, метанол, диоксан, а также обычные фиксаторы, используемые в микробиологической практике: формалин, смесь Никифорова, жидкость Карнуа и др.

Прямой вариант. На готовый препарат наносят специфическую люминесцирующую сыворотку на определенное время, затем излишек сыворотки сливают, препарат промывают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Этот метод применяют для обнаружения бактерий в патологическом материале, объектах внешней среды, а также для идентификации возбудителей заболеваний в культурах.

Непрямой (двухступенчатый) вариант. На первом этапе происходит специфическое соединение антигена с соответствующим антителом немеченой сыворотки. На втором этапе специфическое немеченое антитело связывается с антивидовым люминесцирующим антителом, содержащимся в сыворотке животного, иммунизированного глобулинами (или цельной сывороткой крови) того вида животных, от которых была использована иммунная сыворотка.

Непрямой антикомплементарный (трехступенчатый) вариант. Первый этап: образование комплекса антиген — немеченое антитело. Второй этап: наслаивание нормальной сыворотки, содержащей комплемент. Третий этап: комплекс антиген — антитело — комплемент обрабатывают люминесцирующей антикомплементарной сывороткой, приготовленной при иммунизации кроликов сывороткой того вида животного, которое служило источником комплемента.

Непрямые варианты МФА можно использовать как для выявления антигенов, так и для определения антител. Кроме того, для постановки двухступенчатого варианта нужно иметь ограниченный набор антивидовых люминесцирующих сывороток (против глобулинов быка, барана, лошади, свиньи и др.), а для антикомплементарного варианта достаточно иметь всего одну люминесцирующую сыворотку против глобулинов морской свинки.

Методика иммунолюминесцентной микроскопии. В практике ветеринарных бактериологических лабораторий используют люминесцирующие сыворотки биофабричного производства. В зависимости от типа флуорохрома люминесцирующие сыворотки обеспечивают либо зеленое свечение объекта (краситель на основе флуоресцеина), либо красное (краситель на основе родамина).

Для проведения иммунолюминесцентной микроскопии следует на обезжиренное тонкое без царапин предметное стекло нанести исследуемый материал. При исследовании органов и тканей животных готовят препараты-отпечатки тонким слоем. Препараты подсушивают на воздухе и помещают в фиксирующую жидкость (этанол — 15 мин, метанол — 5 мин, ацетон — 5 мин). Если необходимо, после фиксации препараты некоторое время можно сохранять в холодильнике. Последовательность и дальнейшие процедуры зависят от применяемого варианта МФА

Реакция нейтрализации. Используется только для определения принадлежности бактерийных токсинов в исследуемом материале для установления активности антитоксических сывороток. В пробирки с равным количеством антигена (в 1мл, например, 1000 смертельных доз столбнячного токсина) добавляют равный объем убывающего количества (убывающей концентрации) специфической гипериммунной антитоксической сыворотки; пробирки помещают в термостат на 1-2 ч. Затем из каждой пробирки смесь-токсин-антитоксин вводят лабораторным животным (по 2 животных на каждую дозу антитоксина). Животные, которым ввели смесь, где произошла нейтрализация токсина, остаются живыми. Наименьшее количество сыворотки, нейтрализовавшее токсин, принимается за единицу активности антитоксической сыворотки (АЕ)