Классикалы ПЦР дісі

Тізбекті полимеразды реакция Тізбекті полимеразды реакцияны 1983 жылы Кэри Маллисом ашан. Оны масаты ДН ферментті полимеразаны кмегімен ДН-ны амплицирлеу жне ДН- алашы молекуласыны барысымен кптеп екі еселенуі. Тізбекті полимеразды реакция (полимераза цепная реакция)– бл молекулалы биологияны экспериментальді дісі, биологиялы материалда (сынамада) нуклеин ышылыны (ДН, РН) белгілі фрагменттеріні аз концентрациясын кбірек игеру. Негізгі олдану крсеткіштері: Инфекциялы ауруларды диагностикасы- ГЕПАТИТТІ БАРЛЫ ТРЛЕРІНЕ ТЕКСЕРІЛЕСІЗ. Онкологиялы ауруларды диагностикасы (лейкемиялар жне лимфомалар, ст безі рагі т.б. атерлі жаатзілістер); Генетикалы аурулар диагностикасы; Жеке идентификация (сот медицинасы жне криминалистика, мшелер мен тіндер трансплантациясы, генетикалы тест арылы келікті анытау ); Таам патогенділігіні диагностикасы . ТПР САТЫЛАРЫНЫ ЕРЕКШЕЛІКТЕРІ: ТПР 3 негізгі сатыдан трады,. Бл цикл термоциклді аппаратта жреді, ол оте аз уаыт ішінде оспалы реакцияны температурасын жоарылатады немесе тмендетеді. Денатурация – 94°C жуы: Денатурация кезінде ДНК- 2 тізбегі балиды да бір тізбекті болып тзіледі. (барлы энзимді реакциялар тотайды). Аннеалинг (кйдіру) – 54°C жуы: Сутектік байланысы біртіндеп ралады жне бір тізбекті ДНК мен жалыз праймерлер арасы бзылады..рбір цикл ДНК жібіні санын екі еселендіреді. Нтижесінде ДН кесіндісінде праймерлер арасындаы тзілістерді клемі кенеттен жоарылайды. 20 циклдан кейін синтезделген ТПР німіні саныны клемі 1 млн. дейін жетеді. 40 циклдан кейін — 1 x 1012 ТПР-ды асиеті: Арнайылыы Жргізілуі Сезімталдыы Сенімділігі ТПР ерекшеліктері: Nested PCR (яшыты – праймерлермен салынан ТПР RT-PCR – пцр , матрицаны орнына РНК олданылуы, реакцияны кері транскрипциямен жруі Real time PCR – ТПР шынайы уаыт тртібінде зерттеуді жасалынуы Тізбекті полимеразды реакцияны німіні дрыс шыуына шыуы жне арнайылыын жасартатын німдер: Tа ДНК-а жне праймерлерге – формамид, диметилсульфоксид (ДМСО), сперимидиндерге сер етушілер ДНК (белок SSB, белок 34 фагтара Т4) конформациясына сер етушілер Полимераза асиетіне сер етушілер (бетаин, желатин, глицерин) Амплификация бадарламасы алай ралады: Реакциялы оспаны біріншілік ыздыру – 90-95 0С – 1-5 мин ДН денатурациясы- 90-95 0С – 5-10 сек. Праймерлерді кйдіру– 50-55 0С – 10-15 сек Элонгация (праймерлерді алып тастау) –68-72 0С Циклдер саны — 38-40 Соы элонгация (соы ралуы) –72 0С – 5-10 мин ТПР німдерін сатау – 4-10

ДН чип дісі

ДН биочиптері – аылшын тілінде аталуы DNA – microarrays, шыныдан, полимерлерден, гельден (полиакриламид) немесе пластикадан дайындаан арнайы алыпта, пластина-платформасында йымдастырылып орналасан ДН молекулалары. Кей жадайда баса материалдар да олданады, мысалы электронды микросхемалара салатын кремнийді. ДН биоматериал ретінде шнырда гидрогельмен (гельді биочиптер) немесе чипті тыыз алыпында иммобилизацияланан (беткейлік биочиптер) болуы ммкін. ДН молекуласын иммобилизациялау шін алыпты бетін арнайы реактивтермен – органотриалкоксиланмен, глицидилоксисиланмен жне т.б. нделінеді. Осылай нделу барысында беткейлік атомдар мен модификацияланан реагентер арасында силоксанды кпір пайда болады, нтижесінде олигонуклеотидтерді иммобилизациясына ажетті немесе «аяты» бірнеше сатыдан кейін алыптасуы олигонуклеотидтерді лкен конформациялы бостандыын амтамасыз ететін алыпты бетінде кп санды функциональды топтар (негізінен, амин топтары) райды. Робот кмегімен ДН бір жіпті фрагменттері – олигонуклеотидтер (ысалары – 15-60 нуклеотидтер жне зындары – 100-3000 нуклеотидтер) иммобилизацияланады (негізінен, ковалентті), (сур.19). Сондытан биочиптерді олигонуклеотидті жне ДН-ды беткейлік трлеріне бледі. Платформада йымдастырылып орналасан ДН пошта маркасынан визитті карточкадай жерде орналастырады. Биочипті микроскопиялы клемінде тексерілетін материалды комплементарлы нуклеин ышылдар жіптерімен байланысу абілеті бар одаан жне жздеген мы трлі олигонуклеотидтер, ДН фрагменттер орналастыруа болады. Осылай дайындаан ДН-биочипті бояумен табаланан зерттелетін ДН молекуласымен гибридизация жасайды жне оуа арналан флюоресцентті микроскоп немесе арнайы лазерлі ондырымен шнырлардаы апаратты оып шыарады. ДН-биочиптері кеінен таралан жне шыны алыпында орналасады.

ДН-биочипті олдану сызбансасы: 1) талдау материалынан бліп алынан гибридті (зерттелетін) ДН алдымен ПТР кмегімен кп клемде жинайды. Жетілдірген модельдерде гибридизация жасайтын ассимЕтриялы мультипраймерлі ПТР-амплификация бірден биочип шнырларында теді. Сонымен атар, осы чипте ДН фрагментациясы, фосфорилдену, лигирленуі жреді. Зерттелетін ДН амплификациядан кейін рестриктаза-ферментерімен белгілі фрагменттерге блінеді де флуоресцентті табасы бар фрагменттерді коньюгациялауына алашы нделуден теді. Тексерілетін ДН рылымды бліктері болып келетін кптеген санды табаланан олигонуклеотидтер жинаы пайда болады; 2) диагностикалы белгілі олигонуклеотидтері бар биочипті гельдік микрошнырларына тексерілетін (гибридизацияланатын) ДН микротамшысы тамызылады; 3) шыныда біржіпті олигонуклеотидтерді енгізіп тексерілетін нуклеин ышылдарыны гибридизациясы жреді. ДН комплементарлы жіптеріні гибридизация процесі жруіне чипті тнге термостата инкубация жасайды. Егер тексерілетін сынамада олигонуклеотид шыра бекітілгенге комплементарлы болан жадайда оларды арасында байланыс орныады, ортаны шайанда олар алып ояды, ал байланыспаан олигонуклеотидтер шайылып кетеді; 4) арнайы компьютерлі бадарламалар олданатын анализаторлар кмегімен гибридизация орытындыларына визуализация жне шыан суреттемеге талдау жасалынады (сур.20,21). Осы масатта шайып алан биочипті кептіреді де анализатор кмегімен шнырлардаы флуоресцентті жарытануды активтілігін анытайды.