Определение токсигенности дифтерийной палочки реакцией преципитации в геле
Реакция Райта
Развернутая РА для определении АТ при бруцеллезе
Компоненты:
1. Сыворотка, разведенная в физрастворе двукратно (АТ)
2. Единый бруцеллезный диагностикум (АГ) (голубой, единственный подкрашенный)
Инкубация - 20 ч.
Механизм: при наличии АТ образуются хлопья агглютинации, оседающие на дно.
Титр АТ – наибольшее разведение, при котором еще есть агглютинация.
Реакция Манчини
Реакция преципитации в геле для определения уровня Ig – метод радиальной иммунодиффузии
Образцы исследуемых сывороток помещают в лунки агарового геля, который содержит АТ против IgG, IgM или IgA в известной концентрации. Диффундирующие в агар Ig образуют кольца преципитации с антиглобулиновыми антителами, размер которых зависит от содержания в сыворотке Ig соответствующего класса. . По разведениям стандартной сыворотки строится калибровочная кривая, по которой определяется уровень Ig в исслед.сыворотке. Уровень сывороточных Ig отражает функциональное состояние B-системы организма.
Постановка ориентировочной РА для определения неизвестного микроба
Компоненты: 1. Взвесь неизвестной культуры в физ.р-ре (АГ в электролите)
2. Диагностические аггл. сыворотки (АТ): н-р, 1) поливалентная эшерихиозная 2) типовые О-26, О-55, О-111.
Механизм: при соответствии антигена антителу – хлопья агглютинации.
Окраска по Граму (чистая культура)
Позволяет выявить особенности строения КС бактерий
Стекло обезжирить мылом. Капля 0,9% NaCl. Культуру бакпетлей в каплю. Сушим. Фиксируем (3 раза провести над пламенем горелки). Генцианвиолет (бумажки по Синеву) смочить водой 1-2 мин. Р-р Люголя – 1-2 мин. Стряхиваем и краситель, и Люголь. Этиловый спирт – 30-60 с, до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя (опустить 3 раза). Промывание водой. Фуксин Пфейффера – 3-5 мин. промыть водой. Грам(+) не обесцвечиваются спиртом и сохраняют окраску певрого красителя (многослойный пептидогликан КС взаимодействует с краской и задерживает её в комплексе с йодом), грам(-) обеспечиваются спиртом и окрашиваются вторым красителем.
Окраска по Гинса-Бури
Позволяет выявить капсулу бактерий (называется негативным, так как капсула не прокрашивается)
В каплю черной туши внести культуру, смешать и 2 стеклом со шлифованным краем приготовить мазок, как из крови. Высушить. Зафиксировать на воздухе. Фуксин Пфейффера – 1-2 мин. Капсула не воспринимает красители, поэтому окрашиваем бактерии и окружающий фон. Фон окрашивается тушью в черный цвет, а возбудитель фуксином в розовый цвет, при этом капсула видна в виде светлого ободка вокруг бактерий.
Окраска по Ожешко
Позволяет окрасить споры бактерий.
На нефиусированный мазок 0,5% HCl – 3 мин с прогреванием (протрава). промывание водой (осторожно). Фиксация в пламени спиртовки. Окраска по Цилю-Нильсену. Спора, как кислотоустойчивая структура красится в красный цвет, а цитоплазма клетки, как кислотонеустойчивая структура – в синий цвет.
Окраска по Цилю-Нильсену
Позволяет определить кислотоустойчивые бактерии.
Карболвый фуксин Циля 3-5 мин. Промывание водой. 5% H2SO4 1-2 мин (для обесцвечивания). промывание водой. Метиленовая синь 3-5 мин. Промывание водой. Кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются после первого красителя, так как содержат больше липидов, воска, окислителей, поэтому окрашиваются в красный цвет. Кислотонеустойичвые бактерии и структуры обесцвечиваются после первого красителя, поэтому красятся в голубой цвет.
Тельца Бабеша-Негри
Цитоплазматические включения в нейронах (срезы аммонова рога и мозжечка), клетках слюнных желез при бешенстве – индикация вируса. Красные на голубом фоне.
Среда Эндо (диф.-диагн.) (МПА + 1% лактоза + осн.фуксин, обесцвеч. тиосульфитом натрия), Lac(+) – темно-красные колонии с металлич.блеском; для выявления энтеробактерий (сахаролитические свойства).
Среда Левина(диф.-диагн.) (МПА + 1% лактоза + метилен.синь и эозин), Lac (+) – насыщ. синего цвета; для выявления энтеробактерий (сахаролитические свойства).
Среда Плоскирева (диф.-электив.) (МПА + 1% лактоза + нейтр.красный + соли желч.к-т + бриллиант.зелен.) (для шигелл и сальмонелл); Lac (+) – красные.
Среда Раппопорта (желтая) (электив.-диф. для сальмонелл и шигелл) (МПБ + 1% желчь (электив.ф-р) + глю(диф.ф-р) + инд-р Андреде(кислый фуксин + NaOH): S.typhi –до кислоты (красный), S.paratyphi A,B – до кислоты и газа. Разливается в бутылки и колбы, т.к. в начале болезни сальмонеллы находятся в крови. Берут 5 мл крови и разбавляют в 10 раз (до 50 мл).
ЩПВ - щелочно-пептонная вода (селектив) (1% пептонная вода + 0,5% NaCl + KNO3 + Nа2CO3; pH = 9,0). Щелочь – селективный фактер для холерного вибриона.
Сахарный бульон (универсальная) (триптоза + мясной экстракт + глю + NaCl )
КА (диф-диаг) (агар+эритроцитарная масса). Для определения гемолизирующих свойств бактерий. Гемолиз: – Hb превращается в гемосидерин (зеленый), – просветы вокруг колоний, – отсутствие гемолиза.
ЖСА (элективн)(МПА + желточная взвесь + 10% NaCl). Для выявления фермента патогенности лецитовиттелазы (лецитиназы). (+) помутнение вокруг колоний.
МПБ (универсальная)(мясная вода + пептон + 0,5% NaCl).
Китта-Тароцци (для анаэробов) (сахарный бульон + кусочки паренхиматозных органов (для адсорбции О2) + высокий столбик + слой вазелинового масла (для изоляции от атмосферного воздуха). Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в теч 10-15 мин для удаления воздуха
.
Вильсона-Блера (железосульфитный агар) (3% МПА + 1% глю + 20% сульфит натрия + 8% FeCl3) Разливают высоким столбиком, сверху – вазелиновое масло (для изоляции от атмосферного воздуха). Позволяет выявить сероводородную активность. Анаэробы образуют колонии черного цвета за счет восстановления сульфита натрия, который, соединяясь с FeCl3 дает осадок сульфата железа черного цвета.
Игла –синтетическая (13 АМК, 7 витаминов, на основе сбалансированного солевого раствора Эрла). Питательный раствор для культур клеток, используемых для культивирования вирусов.
199 – синтетическая(20 АМК, 17 витаминов, глюкоза, минеральные соли, пурины и пиримидины – всего 199 компонентов, на основе сбалансированного солевого р-ра Хенкса). Питательный раствор для культур клеток, используемых для культивирования вирусов.
Бланки:
· хроническая гонорея – кровь / серологическое
· острая гонорея - гной / бактериоскопическое, бактериологическое
· дизентерия – испражнения / бактериологическое
· холера – испражнения / бактериологическое
· брюшной тиф – кровь, испражнения / бактериологическое, серологическое
· коклюш – отделения из носоглотки / бактериологическое
· дифтерия – пленки / бактериологическое
· сибирская язва – содержимое карбункулов / бактериологическое
· корь – кровь / серологическое
· полиомиелит – кровь, ликвор / серологическое
Определение токсигенности дифтерийной палочки реакцией преципитации в геле
В чашку Петри с питат.агаром кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Засевают исследуемые культуры, в качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру. При размножении токисгенной культуры в месте соединения токсина с антитоксином в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий – «усов».