Д. Практические навыки, приобретаемые на занятии
А. Основные положения
Ретровирусы: классификация.
Семейство Retroviridae включает в себя роды: Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus, Lentivirus и Spumavirus. Первые пять из них содержат онкогенные РНК-геномные вирусы (онкорнавирусы), а род Lentivirus – вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).
Ретровирусы: характеристика семейства.
Ретровирусы содержат в составе вириона обратную транскриптазу и имеют диплоидный геном.
История открытия ВИЧ.
Вирус был выделен независимо друг от друга Галло (США) и Монтанье (Франция).
Вирионные белки ВИЧ.
В шипы суперкапсида ВИЧ содержат гликолизированные белки gp120 (исключительно быстро изменяющийся в результате антигенного дрейфа) и gp41, а сердцевина – структурные белки (например, капсидный р24) и ферменты (в том числе обратную транскриптазу).
Геном ВИЧ-1.
Для генома ВИЧ характерно большое количество регуляторных генов и наличие длинных концевых повторов, обеспечивающих интеграцию вируса в геном клетки-хозяина и регуляцию экспрессии генов провируса.
Отличия генома ВИЧ-1 от ВИЧ-2.
Геном ВИЧ-2 отличается от генома ВИЧ-1 геном, детерминирующим синтез поверхностных белков (шипов) и одним из генов, регулирующих процесс репликации провируса.
Типы ВИЧ.
Вирус иммунодефицита человека имеет два типа: ВИЧ-1 (основной возбудитель СПИДа) и ВИЧ-2 (эндемичный для Западной Африки и редко встречающийся в других регионах).
Классификация ВИЧ-1.
Все изоляты ВИЧ-1 классифицируется на три группы. Большинство относится в группе N, в рамках которых выделяют подтипы ВИЧ.
Фенотипы ВИЧ.
По тропизму к ко-факторам (рецепторам к хемокинам, «помогающим» вирионному белку gp120 в обеспечении адсорбции к клетке-мишени) штаммы ВИЧ классифицируются на М-тропные (макрофаготропные), Т-тропные (Т-лимфотропные) и штаммы с двойной тропностью. Прогрессирование ВИЧ-инфекции сопровождается сменой фенотипа вируса от М- к Т-.
Жизненный цикл ВИЧ в CD4-лимфоцитах.
При взаимодействии с рецепторами адсорбции (молекулой CD4 и хемокиновым рецептором) на поверхности лимфоцита прикрепительного белка ВИЧ (комплекс gp120+gp41) происходит изменение конформации gp120, что позволяет gp41 взаимодействовать к клеточной мембраной в качестве фактора слияния, что, в свою очередь, приводит к попаданию сердцевины вируса внутрь клетки. Затем, после высвобождения вирионной РНК, вирионная обратная транскриптаза ферментирует синтез на её матрице ДНК-транскрипта, который проникает в ядро лимфоцита и интегрируется в хромосомную ДНК, где – в виде репрессированного провируса – сохраняется до момента инициации своей транскрипции. РНК-транскрипт переносится в цитоплазму клетки, где формирует геномный фонд ВИЧ и служит матрицей для синтеза вирионных белков. После сборки вирионов, последние отпочковываются от клеточной мембраны, вызывая множественные нарушения её целостности, что и приводит к гибели CD4-лимфоцита.
Пути передачи ВИЧ.
Основной путь передачи ВИЧ – половой. Вирус передаётся также парентерально, возможен и трансплацентарный путь передачи.
ВИЧ-инфекция: группы повышенного риска.
В группу повышенного риска входят лица, практикующие гомосексуальные связи, наркоманы, применяющие шприцевые наркотики, проститутки, люди, часто меняющие своих половых партнёров, больные гемофилией.
Типичная модель распространения ВИЧ.
Первоначально вирус концентрируется в группах риска, а затем через половых партнёров членов этих групп распространяется на основную популяцию населения.
Биологические жидкости, содержащие ВИЧ.
Все биологические жидкости инфицированного организма содержат вирус, однако его количество, достаточное для заражения, содержится в крови, сперме, влагалищном и цервикальном секрете, грудном молоке и ликворе.
Взаимодействие ВИЧ с организмом человека.
Вирус проникает в организм через слизистую оболочку гениталий или прямой кишки, через кровь или через плаценту, после чего инфицирует клетки-мишени, как имеющие CD4 (Т-хелперы, моноциты/макрофаги), так и содержащие подобные ей молекулы (астроциты, эндотелиальные и эпителиальные клетки). После истечения инкубационного периода наступает прогрессирующая активация репликации вируса, что вызывает гибель CD4-лимфоцитов, обуславливающее не только снижение количества Т-хелперов, но и – в результате изменения синтеза цитокинов – дискоординацию других показателей иммунного статуса. Развивается выраженная дисфункция иммунной системы, а как её результат – присоединение СПИД-ассоциированных болезней, приводящих больного к гибели.
Основные СПИД-ассоциированные инфекции.
К основным СПИД-ассоциированным инфекциям относятся: пневмоцистная пневмония, МАК-инфекция, цитомегаловирусная и другая герпетическая инфекция, кандидоз.
ВИЧ-инфекция: методы лабораторной диагностики.
В лабораторной диагностике ВИЧ-инфекции применяют: выявление специфических антител (с помощью ИФА и иммуноблотинга), выявление вирусного антигена (с помощью тех же реакций), детекцию вирусного генома (с помощью ПЦР), выделение вируса (т.е. – его культивирование).
ВИЧ-инфекция: косвенные показатели.
К косвенным показателям ВИЧ-инфекции относятся: количество CD4-лимфоцитов, соотношение CD4-лимфоцитов к CD8-лимфоцитам.
ВИЧ-инфекция: серологическая диагностика.
Для серологической диагностики ВИЧ-инфекции используется ИФА (для выявления общего количества специфических антител) и иммуноблотинг (для выявления антител к отдельным белкам вируса).
ВИЧ-инфекция: освидетельствования групп риска.
Освидетельствование групп риска соответствует общей стратегии диагностики ВИЧ-инфекции: с помощью ИФА выявляют специфические антитела (и в положительном и в отрицательном случае необходимо повторное исследование), в положительном случае в качестве подтверждающего теста используют иммуноблотинг. В положительном случае ставится диагноз «сероконверсия» и, в случае последующей детекции антигена вируса или выделения самого вируса – «ВИЧ-инфекция».
Выделение (культивирование) ВИЧ.
Из периферической крови пациента выделяют фракцию мононуклеарных клеток (МПК), которые сокультивируют с такими же клетками донора, обработанными фитогемагглютинином, после чего определяют маркеры репликации вируса (активность обратной транскриптазы, наличие капсидного белка, вирусной РНК, изменение клеток в результате ЦПД). В положительном случае вируссодержащим супернатантом (первичной культурой вируса) заражают, для изучения фенотипа выделенного вируса, культуру Т-лимфобластоидных клеток, экспрессирующих CD4.
Д. Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Расшифровка показателей иммунограммы (повторение навыка для его закрепления).
2. Учёт реакции иммунофенотипирования лимфоцитов (повторение навыка для его закрепления).
3. Иммунопрепараты (повторение навыка для его закрепления).
31Г. Тестовые вопросы по теме занятия
Ретровирусы:
ДНК-геномные
-РНК-геномные
простые
-сложные
У ретровирусов:
-одноцепочечная нуклеиновая кислота
двухцепочечная нуклеиновая кислота
-«плюс-нить» нуклеиновой кислоты
«минус-нить» нуклеиновой кислоты
гаплоидный геном
-диплоидный геном
Какие роды семейства Retroviridae содержат онкогенные РНК-геномные вирусы (онкорнавирусы):
-Alpharetrovirus
-Betaretrovirus
-Gammaretrovirus
-Deltaretrovirus
-Epsilonretrovirus
Lentivirus
Spumavirus
Какой род семейства Retroviridae содержит вирус иммунодефицита человека (ВИЧ):
Alpharetrovirus
Betaretrovirus
Gammaretrovirus
Deltaretrovirus
Epsilonretrovirus
-Lentivirus
Spumavirus
Какой белок ВИЧ исключительно быстро изменяется в результате антигенного дрейфа:
-gp120
gp41
р24
Какие белки ВИЧ содежатся в шипах суперкапсидной оболочки:
-gp120
-gp41
р24
Капсидный белок ВИЧ:
gp120
gp41
-р24
Для генома ВИЧ-1 характерно:
-большое количество регуляторных генов
малое количество регуляторных генов
-наличие длинных концевых повторов
отсутствие длинных концевых повторов
Длинные концевые повторы генома ВИЧ обеспечивают:
адсорбцию вируса на чувствительной клетке
депротеинизацию вируса
-интеграцию вируса в геном клетки-хозяина
-регуляцию экспрессии генов провируса
сборку вирионов
отпочковывание вирионов от клетки-хозяина
Основной возбудитель СПИДа:
-ВИЧ-1
ВИЧ-2
ВИЧ-2:
встречается с одинаковой частотой во всех регионах земного шара
-эндемичен для Западной Африки
эндемичен для Южной Африки
эндемичен для Европы
эндемичен для Северной Америки
эндемичен для Южной Америки
эндемичен для Азии
Большинство изолятов ВИЧ-1 относятся к группе:
M
-N
О
Прогрессирование ВИЧ-инфекции сопровождается сменой фенотипа вируса:
-от М- к Т-
от Т- к М-
прогрессирование ВИЧ-инфекции никак не связано со сменой фенотипов вируса
Какой из белков ВИЧ при проникновении вируса в чувствительную клетку взаимодействует с клеточной мембраной в качестве фактора слияния:
gp120
-gp41
р24
Основной пусть передачи ВИЧ:
-половой
парентеральный
трансплацентарный
Количество ВИЧ, достаточное для заражения, содержится:
-в крови
-в сперме
-во влагалищном секрете
в слюне
Количество ВИЧ, достаточное для заражения, содержится:
-в цервикальном секрете
-в грудном молоке
-в ликворе
в поту
В лабораторной диагностике ВИЧ-инфекции ИФА используют для:
-выявления специфических антител
-выявления вирусного антигена
детекции вирусного генома
В лабораторной диагностике ВИЧ-инфекции иммуноблотинг используют для:
-выявления специфических антител
-выявления вирусного антигена
детекции вирусного генома
В лабораторной диагностике ВИЧ-инфекции ПЦР используют для:
выявления специфических антител
выявления вирусного антигена
-детекции вирусного генома
К косвенным показателям ВИЧ-инфекции относятся:
-количество CD4-лимфоцитов
количество CD8-лимфоцитов
-соотношение CD4-лимфоцитов к CD8-лимфоцитам
количество макрофагов
количество В-лимфоцитов
количество NK-клеток
Для выявления общего количество антител против ВИЧ используется:
иммуноблотинг
-ИФА
Для выявления антител к отельным белкам ВИЧ используется:
-иммуноблотинг
ИФА
Подтверждающий тест при выявлении антиВИЧ-антител:
ИФА
-иммуноблотинг
РСК
ПЦР
РНГА
РГА
При выделении (культивировании) ВИЧ первичную культуру вируса получают (в случае регистрации маркеров репликации вируса) при сокультивировании:
-фракции мононуклеарных клеток периферической крови исследуемого пациента
-фракции мононуклеарных клеток периферической крови донора, обработанных фитогемагглютинином
культуры Т-лимфобластоидных клеток, экспрессирующих CD4
При выделении (культивировании) ВИЧ изучение его фенотипа осуществляют при заражении:
фракции мононуклеарных клеток периферической крови исследуемого пациента
фракции мононуклеарных клеток периферической крови донора, обработанных фитогемагглютинином
-культуры Т-лимфобластоидных клеток, экспрессирующих CD4